THBJC-0032020-畜禽粪便废弃物堆肥处理中抗生素抗性基因的测定方法_第1页
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T/HBJC003—2020-12-01发 2020-12-16实黑龙江省标准技术创新协 发T/HBJC003—T/HBJC003— 前 引 本文件依据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起本文件起草人:魏自民、温铁军、张旭、史明子、齐海石、吴迪。 T/HBJC003—T/HBJC003—etttQttSttWttOteteteteHsl、sul2sul）（cml、flR、fxA、f、fex）rmQ、rmXerm）、喹（grA拷贝数GB/T （q）NTqmaDNTaman水：GB/T6682PCRSYBRGreenMix50mg/mLEDTA1.5mLEPDNA堆肥样品中抗生素抗性基因含量应大于500拷贝数/g50mL10mL脱腐缓冲液、10mLPBS缓冲液；1000rpm1%DNADNAOD260DNA储存于-20ºCA.1ARGsPCR扩增，模板为DNA1%PCR产物进行验证；将PCRPMD18-T载体上，将连接产物转入E.coliDH5α从阳性克隆子中提取重组质粒，再次对重组质粒进行PCR质粒的浓度，L为重组质粒的大小（pMD18-T载体大小+目的基因片段大小，bp）；107个浓DNAPCR扩增，查看扩增曲线和融解曲线确认扩增效果良好。以CT值为横坐标，log（copies）为纵坐标，建立一元线性方程，置于-20ºC冰箱中保存。0.1mL96孔板的每个孔中分装18μL混合液（2×ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix10µl；Primer1(10µM4µl；Primer210µM4µl），然后加2μLDNA模板，阴性对照加入2μLDEPC水代替DNA模板，预变性：95ºC40个循环扩增：95ºC10s溶解曲线检测：95ºC15s，60ºC60s，95ºC根据反应CT值带入标准曲线计算出未知样品中目的基因的浓度（copies/μLDNA）…………(1 96孔板，保证每种抗性基因的纯度，对每个孔中的抗附录A.1PCRPCRA.1PCR序列AGCCTTACCAATGGGTGTTTCTTACCT

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