ISO 20397-12022 生物技术.大规模平行测序.第1部分核酸和文库制备标准立项发展报告

生物技术大规模平行测序第1部分：核酸和文库制备标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part1:Nucleicacidandlibrarypreparation摘要关键词：大规模平行测序；核酸制备；文库构建；国际标准；ISO20397；生物技术标准化；质量控制AbstractWiththerapidadvancementoflifescienceresearchandtheaccelerateddevelopmentofprecisionmedicine,MassivelyParallelSequencing(MPS)technologyhasbecomeacoretoolinmodernbiologicalresearchandclinicaldiagnostics.However,theabsenceofunifiedinternationalstandardshasledtosignificantdiscrepanciesindataquality,comparability,andreproducibilityacrossdifferentlaboratoriesandplatforms,severelyconstrainingtheclinicalapplicationandindustrialdevelopmentofthistechnology.Againstthisbackdrop,theInternationalOrganizationforStandardization(ISO)officiallyreleasedISO20397-1:2022,"Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part1:Nucleicacidandlibrarypreparation,"onMarch17,2022.Thisreportsystematicallyreviewsandanalyzestheprojectbackground,compilationprocess,coretechnicalcontent,andindustrialimpactofthestandard.ThereportfirsttracestheevolutionofMPStechnologyfromfirst-generationtothird-generationplatformsandthecorrespondingdevelopmentofstandardizationdemands.Itthenelaboratesonthekeytechnicalspecificationscoveredbythestandard,includingnucleicacidextractionandqualitycontrol,libraryconstruction,andqualityassessment.Furthermore,thereportprovidesanin-depthanalysisofthestandard'smultidimensionalvalueininternationaltrade,clinicaldiagnostics,regulatorycompliance,andindustrialecosystemoptimization.Finally,thereportdiscussesfuturedirectionsfortheMPSstandardssystem,emphasizingthatthecontinuedrefinementofthisstandardserieswillstronglypromoteglobalcollaborationandhigh-qualitydevelopmentinthelifesciencesfield.Keywords:MassivelyParallelSequencing;NucleicAcidPreparation;LibraryConstruction;InternationalStandard;ISO20397;BiotechnologyStandardization;QualityControl一、引言1.1研究背景大规模平行测序技术，又称下一代测序（Next-GenerationSequencing,NGS），自2005年首次商业化应用以来，已深刻改变了生命科学研究的范式。该技术能够在单次运行中对数百万乃至数十亿条DNA片段同时进行测序，大幅降低了测序成本并提高了通量，使得全基因组测序、转录组分析、表观遗传学研究以及临床基因检测等工作变得可行且高效。据MarketsandMarkets市场研究报告显示，全球测序市场规模预计将从2022年的约130亿美元增长至2027年的300亿美元，年复合增长率达到18.2%。伴随技术渗透率的持续提升，MPS技术在实际应用中暴露出的问题也日益突出——不同测序平台（如Illumina、ThermoFisher、华大智造等）之间，甚至同一平台不同实验室之间的测序结果存在显著偏差，尤其是在低丰度变异检测、拷贝数变异分析等敏感应用中，结果可重复性问题尤为严峻。深入分析发现，造成这种差异的原因主要集中于上游环节——核酸提取的质量、文库构建的效率与均一性等前处理步骤缺乏统一的技术规范和质控标准。各实验室往往依据厂商说明书或自建方法操作，导致起始材料质量参差不齐、文库制备流程各异、质量控制指标不一，最终影响测序数据的可靠性和可比性。1.2标准化需求分析在此背景下，国际社会对MPS技术标准化的呼声日益高涨。2017年，国际标准化组织生物技术委员会（ISO/TC276）在充分调研全球MPS技术应用现状及标准化需求的基础上，正式启动了大规模平行测序标准编制工作。ISO/TC276由德国标准化协会（DIN）担任秘书处，其工作范围涵盖了生物技术领域的术语、分析方法、生物过程、生物数据与生物信息学等多个方向。该标准的编制旨在解决以下核心问题：-质量控制指标不统一：不同实验室对核酸纯度、完整性、文库浓度等关键质量参数的评判标准各异；-流程规范缺失：从样本接收到文库构建的整个流程缺乏规范化操作指引，导致实验可重复性差；-数据可比性不足：缺乏统一标准使得跨平台、跨实验室的数据比较和整合困难重重；-监管依据薄弱：临床诊断和法规监管领域亟需具有共识的技术基准。ISO20397-1:2022正是针对上述问题制定的首项MPS国际标准，其发布填补了该领域国际标准的空白，为全球大规模平行测序技术的规范化应用奠定了重要基础。二、标准编制历程2.1立项与组织机构ISO20397-1:2022由ISO/TC276生物技术委员会下设的WG3“分析方法”工作组负责编制。WG3的召集人来自中国标准化研究院，这一安排体现了中国在生物技术标准化领域的积极参与和日益增强的国际影响力。工作组汇集了来自中国、美国、德国、英国、日本、韩国等国家的标准化专家和技术专家，共同参与标准的起草和讨论工作。2.2标准编制时间线该标准的编制工作经历了严谨的多阶段审议程序，主要节点如下：-2017年：ISO/TC276全会正式通过立项提案，成立特别工作组启动标准预研工作；-2018年：工作组完成标准草案初稿（WorkingDraft,WD），确定了标准的总体框架和技术要素；-2019年：形成委员会草案（CommitteeDraft,CD），在ISO/TC276成员国范围内征求意见；-2020年：完成国际标准草案（DraftInternationalStandard,DIS），经各成员国投票表决通过；-2021年：完成最终国际标准草案（FinalDraftInternationalStandard,FDIS），进入出版准备阶段；-2022年3月17日：ISO正式发布ISO20397-1:2022。2.3各国参与情况在标准编制过程中，各主要成员国均积极参与讨论和技术贡献。中国派出中国计量科学研究院、中国检验检疫科学研究院、深圳华大生命科学研究院等单位专家深度参与标准起草工作，在文库制备质量标准制定、文库质量评价方法等方面提出了多项建设性意见，多项技术建议被采纳进入最终标准文本。美国和德国的专家则在测序平台技术指标和生物信息学分析规范方面发挥了重要作用。三、标准技术内容解析3.1标准适用范围ISO20397-1:2022规定了大规模平行测序中核酸提取和文库制备的通用要求与指南，适用于所有使用MPS技术进行核酸序列测定的实验室，包括但不限于：-科研机构中进行的基础生物学研究；-医疗机构中开展的临床基因检测；-第三方检测机构提供的测序服务；-生物制品和体外诊断试剂生产企业；-法医学鉴定和海关检验检疫机构。3.2主要技术要素该标准的章节架构和技术要素主要包括以下几个方面：3.2.1核酸质量评价指标体系标准规定了用于测序的核酸样品应满足的质量要求，明确了基因组DNA和总RNA的纯度（OD260/280比值、OD260/230比值）、完整性（DNA的DNAIntegrityNumber评分、RNA的RNAIntegrityNumber值）以及浓度测定方法。标准规定了DNA和RNA质检的具体方法，并给出了各质量参数的推荐阈值范围。3.2.2文库构建流程规范标准从以下维度对文库构建流程进行了规范：-片段化方法：物理法（超声打断）、酶切法等不同片段化方式的操作指南及适用场景；-末端修复与接头连接：关键酶学反应的标准化操作流程及质量控制节点；-扩增条件：PCR循环数控制、扩增偏差的最小化策略；-文库纯化：磁珠法纯化的操作要点和回收效率要求；-文库定量：Qubit荧光定量与qPCR定量的方法选择和质量判定标准。3.2.3文库质量评估标准标准对构建完成后的文库质量评估提出了明确标准，包括：-文库浓度（以nmol/L为单位）的统一表示方法和检测精度要求；-文库片段分布范围的合理判定标准，以及是否符合上机测序要求的判断准则；-接头污染率的允许范围及检测手段。3.3与现行各行业标准的关系ISO20397-1:2022作为MPS领域的顶层国际标准，与各国现有标准之间形成了互补关系。在中国，GB/T40227-2021《体外诊断用品下一代测序仪性能评价方法》和《肿瘤基因变异检测指南》等标准和指南侧重于下游检测应用环节，而ISO20397-1:2022聚焦于上游核酸制备和文库构建环节，两者形成完整的技术标准链条。在临床领域，该标准为美国病理学家学会（CollegeofAmericanPathologists,CAP）的实验室认可要求和美国临床实验室改进修正案（ClinicalLaboratoryImprovementAmendments,CLIA）的相关规定提供了可执行的技术操作基准。四、主要参与单位4.1中国标准化研究院中国标准化研究院是中国唯一从事标准化研究的国家级科研机构，同时也是ISO/TC276国内技术对口单位和WG3工作组召集人承担单位。研究院农业食品标准化研究所下设的生物技术标准化团队长期从事生物技术领域标准化研究，在核酸提取与检测、基因工程、合成生物学等方向积累了丰富的标准化工作经验。在本标准编制过程中，中国标准化研究院主要承担了以下工作：-牵头组织国内专家团队系统梳理MPS技术发展现状和标准化需求，提出标准框架建议方案；-组织国内利益相关方（包括科研机构、测序服务企业、医疗机构、监管机构等）召开多次研讨会，汇集中国在该领域的技术实践和标准需求；-代表中国参加ISO/TC276/WG3历次国际工作会议，深度参与标准技术条款的讨论和起草；-协调国内验证实验的开展，为标准中关键技术指标的确定提供实验数据支撑。4.2其他主要贡献单位-深圳华大生命科学研究院：作为全球领先的基因组学研究机构，在文库制备标准化流程优化方面提供了大量实验数据和技术方案，其自主开发的DNBSEQ测序平台的文库制备经验为标准制定提供了重要参考；-中国计量科学研究院：在核酸测量的计量溯源性方面提供了专业技术支持，为标准中定量检测方法的准确性和可比性提供了计量学保障；-中国检验检疫科学研究院：在标准验证和应用推广方面提供了重要支撑，推动了标准在出入境检验检疫领域的落地应用。五、标准价值分析5.1促进国际贸易与产业全球化ISO20397-1:2022作为国际通用的技术规范文件，极大地便利了测序试剂耗材和服务的跨境流通。标准中统一的质量指标和评价方法使得不同国家和地区的实验室能够基于共同的技术语言开展合作，减少了重复验证的技术壁垒。对于测序设备和试剂制造商而言，遵循该国际标准可简化产品在各国市场的准入程序，降低合规成本。5.2推动临床诊断规范化在临床基因检测领域，ISO20397-1:2022为实验室自建检测方法（LaboratoryDevelopedTest,LDT）的开发和验证提供了重要的技术参考基线。标准中关于核酸质量控制、文库构建规范等方面的明确要求，有助于临床实验室建立标准化的操作流程，降低批间差异和实验室间差异，提高检测结果的临床可靠性。这对肿瘤伴随诊断、遗传病筛查、产前无创检测等临床应用具有重要意义。5.3助力监管与合规体系完善ISO标准作为国际社会广泛认可的技术共识文件，被多个国家和地区的监管机构作为技术审评的参考依据。ISO20397-1:2022的发布为药品监督管理部门、医疗器械审评机构在审查基于MPS技术的体外诊断产品时提供了明确的上游技术要求参考，有助于统一审评尺度、提高审批效率。同时，该标准也为实验室认可机构（如中国合格评定国家认可委员会，CNAS）开展测序实验室能力认可提供了技术判据。5.4优化产业生态与创新环境从产业生态角度来看，该标准的发布有助于引导MPS产业链各环节（样本处理、文库构建试剂、测序仪器、数据分析软件等）向规范化、标准化方向良性发展。对于中小型测序服务企业和初创公司，遵循国际标准可以有效降低技术开发的盲目性，使有限的研发资源聚焦于核心技术突破。此外，标准化也为风险投资提供了更清晰的技术评估框架。六、标准实施现状与展望6.1应用推广现状自2022年3月发布以来，ISO20397-1:2022已在全球范围内得到广泛关注和应用推广。中国作为MPS技术应用大国，已将该标准转化为指导性技术文件，并在国家重点研发计划“生物技术标准化研究”项目中设置了专题对标准进行应用验证。全国生物技术标准化技术委员会（SAC/TC559）积极推动相关国家标准和行业标准的制修订工作，力求与国际标准接轨。在临床领域，多家大型医学检验所已参考该标准更新了文库构建操作规程，有效提升了测序结果的稳定性和可重复性。在国际层面，欧洲分子生物学实验室（EuropeanMolecularBiologyLaboratory,EMBL）、美国国立卫生研究院（NationalInstitutesofHealth,NIH）下属测序中心等知名机构也已在实验流程优化中参考了该标准的技术要求。6.2系列标准规划ISO20397作为系列标准，第1部分仅覆盖了测序流程前端的“核酸和文库制备”环节。标准的后续部分已在规划或编制中：-ISO20397-2：侧重于测序过程中的操作规范和数据质量指标；-ISO20397-3：聚焦于测序数据分析与解读的质量要求。该系列标准的完整发布将实现对MPS技术全流程的系统性标准化覆盖，为全球测序数据的互认和整合提供更全面的技术保障。6.3后续修订与持续发展随着MPS技术本身的快速迭代（如长读长测序技术的成熟、单细胞测序的普及、空间转录组学的兴起等），ISO20397-1:2022在该标准正式发布后即启动了系统性复审的规划。根据ISO标准维护规则，发布后的标准通常每五年进行一次系统复审，以评估是否需要进行修订或更新。考虑到MPS技术领域的发展速度，预计该标准将在复审中纳入针对长读长测序平台的特点的相关更新和补充。七、结论ISO20397-1:2022《生物技术大规模平行测序第1部分：核酸和文库制备》的发布是生物技术标准化领域的重要里程碑事件。作为全球首项专门针对大规模平行测序技术制定的国际标准，它填补了该领域国际标准体系的空白，为测序技术全链条的规范化发展奠定了坚实基础。参考文献[1]ISO20397-1:2022,Biotechnology—Massivelyparallelsequencing—Part1:Nucleicacidandlibrarypreparation[S].Geneva:InternationalOrganizationforStandardization,2022.[2]全国生物技术标准化技术委员会.生物技术标准化发展年度报告(2022)[R].北京:中国标准化研究院,2022.[3]GoodwinS,McPhersonJD,McCombieWR.Comingofage