药品微生物检验指南(试行)

药品微生物检验指南(试行)1适用范围本指南依据《中华人民共和国药典》（2020年版）、《药品生产质量管理规范》（2010年修订版）制定，适用于化学药品、生物制品、中药、药用辅料、直接接触药品的包装材料等在出厂检验、放行检验、监督抽验过程中的微生物学检验操作，规范检验流程，保证结果准确可靠，所有药品微生物检验必须符合本指南要求，国家另有规定的从其规定。2人员资质与操作要求2.1资质要求从事药品微生物检验的人员必须经专业培训，考核合格后方可上岗；掌握微生物检验基础理论、无菌操作技术、生物安全防护知识，每半年至少参加1次专业复训与考核，考核不合格不得上岗。所有直接进入洁净检验区的人员必须每年进行健康体检，患有传染性皮肤病、呼吸道传染性疾病、消化道传染性疾病人员不得从事无菌检验、活菌相关检验工作，痊愈后经体检合格方可重新上岗。2.2操作卫生要求检验人员进入洁净区必须按区域要求更衣，不得化妆、涂指甲油，指甲长度不得超过1mm，不得佩戴饰品（隐形眼镜除外）；进入A级/B级洁净区必须穿戴全套无菌防护服，口罩完全遮盖口鼻，贴合面部，手套遮盖防护服袖口，操作过程中手套被污染或潮湿必须立即更换；每连续操作2小时必须更换口罩，防止微生物交叉污染。检验操作过程中不得交谈，减少走动，避免搅动空气影响洁净环境。3检验环境与设施设备管理3.1洁净度分级要求药品微生物检验操作区洁净度必须符合以下要求：①无菌检查、活菌制品相关检验操作区为A级洁净度，背景环境为B级；采用隔离系统开展无菌检查的，隔离器内部为A级，外部背景不低于D级；②微生物限度检查、控制菌检查操作区洁净度不低于D级。各等级洁净区静态环境参数必须符合以下要求：洁净度等级≥0.5μm悬浮粒子（粒/m³）≥5μm悬浮粒子（粒/m³）沉降菌（φ90mm，cfu/4h）A级≤3520≤20≤0B级≤35200≤29≤10D级≤3520000≤29000≤100洁净区温湿度控制在18℃~26℃，相对湿度控制在45%~65%；不同等级洁净区之间压差不低于10Pa，洁净区与室外大气压差不低于12Pa，每天记录压差、温湿度，超出范围立即调整。环境监测要求：A级区每次检验前必须监测沉降菌、表面微生物，每个工作日监测浮游菌；B级区每周监测1次沉降菌、浮游菌、表面微生物；D级区每月监测1次；所有监测结果必须记录，超出警戒限立即启动偏差调查，不合格环境不得开展检验。消毒管理：洁净区台面、墙面、设备表面采用75%乙醇、0.1%苯扎溴铵、0.5%次氯酸钠轮换消毒，每月更换1次消毒剂种类，避免微生物产生耐药性；每次检验前后都要对操作台面进行消毒。3.3设施设备管理①生物安全柜、超净工作台：每年至少由法定计量机构检定1次，每次使用前开启自净30分钟，消毒工作面，自净结束后方可操作；②培养箱：细菌培养箱温度控制为30℃~35℃，允许偏差±1℃；真菌培养箱温度控制为20℃~25℃，允许偏差±1℃；每天上、下午各记录1次温度，定期校准温度传感器，每季度除霜清洁；③高压蒸汽灭菌器：每次灭菌必须记录温度、压力、时间，常规121℃15min灭菌，对耐热性差的培养基可采用115℃30min灭菌；每周用嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC7953生物指示剂监测灭菌效果，每年检定1次，灭菌不合格的耗材、废弃物不得流出；④滤膜：微生物检验用微孔滤膜孔径为0.45μm，无菌，每批次购进必须做截留效率验证，对≥0.45μm微粒的截留率不低于98%方可使用；⑤实验用水：配制普通培养基用纯化水，配制无菌试验用培养基用注射用水，每季度监测纯化水微生物限度，菌落总数不得超过100cfu/ml。4检验前准备4.1培养基质量控制脱水培养基必须在阴凉干燥环境储存，有效期内使用，每批次购进必须开展适用性检查，包括无菌性检查和促生长试验：①无菌性检查：每批随机抽取10%（不少于2份）配制灭菌后培养，无菌生长为合格；②促生长试验：接种不超过100cfu的标准试验菌，30℃~35℃培养48小时，试验菌生长良好为合格。培养基灭菌后pH值偏差必须控制在规定值±0.2范围内，不符合要求不得使用。培养基配制、灭菌必须记录名称、批号、配方、灭菌参数、配制日期、配制人，可追溯。4.2供试品预处理与方法适用性试验供试品接收后必须核对名称、批号、规格、数量，检查包装完整性，粘贴检验状态标识，防止混淆；开启供试品前必须用75%乙醇消毒外包装表面，无菌检验供试品必须在无菌操作条件下开启。所有供试品检验前必须开展方法适用性试验，确认供试品无抑菌作用或者抑菌作用被消除，具体要求为：采用稀释、薄膜过滤、添加中和剂等方法消除抑菌作用后，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数，与菌液对照组菌落数的比值在50%~200%（微生物限度、控制菌要求不低于70%）范围内，方法方可使用；抑菌性供试品常用处理方法：青霉素类、头孢类抗生素添加β-内酰胺酶灭活，阴离子消毒剂加入卵磷脂中和，非离子型消毒剂加入聚山梨酯80中和，所有处理不得引入抑菌物质，不得影响检验结果。5核心检验项目操作规范5.1无菌检查法本方法适用于要求无菌的药品、药用辅料、直接接触药品包装材料的无菌检验，分为薄膜过滤法和直接接种法。取样量要求：供试品装量<10ml的注射剂，最少取10支；10ml≤装量<100ml，最少取6支；100ml≤装量<500ml，最少取2支；装量≥500ml的大体积注射剂，最少取1瓶/袋；固体无菌制剂每批最少取10个单位制剂。操作要求：①薄膜过滤法：适用于绝大多数供试品，尤其是抑菌性供试品，每个滤膜过滤供试品后，用无菌冲洗液冲洗，冲洗量一般每个滤膜不少于100ml，最多不超过1000ml，保证抑菌成分完全洗脱；冲洗后将滤膜分为两份，一份放入硫乙醇酸盐流体培养基（培养需氧菌、厌氧菌，30℃~35℃培养14天），一份放入胰酪大豆胨液体培养基（培养真菌，20℃~25℃培养14天）；②直接接种法：仅适用于无抑菌作用的非水溶性供试品，每个培养基容器体积不少于100ml，供试品接种量不得超过培养基体积的10%，分别接种两种培养基后按上述条件培养。对照要求：每次试验必须同时设置阴性对照和阳性对照：①阴性对照：用等量无菌冲洗液/溶剂代替供试品，同法操作，阴性对照不得有菌生长，否则试验无效；②阳性对照：接种不超过100cfu的标准菌，硫乙醇酸盐流体培养基接种金黄色葡萄球菌ATCC6538，胰酪大豆胨液体培养基接种白色念珠菌ATCC10231，阳性对照必须在48小时内清晰生长，否则试验无效。5.2微生物限度检查法本方法用于检查非无菌制剂、辅料的微生物污染水平，包括细菌总数、真菌和酵母菌总数计数。取样量要求：每批检验最少取10g或10ml，处方含天然来源辅料的固体制剂最少取30g。操作要求：供试品用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1:10供试液，根据污染预估浓度制备1:100、1:1000系列稀释液；常用方法分为平皿法和薄膜过滤法：①平皿法：取1ml供试液注入平皿，倒入融化的培养基摇匀，凝固后倒置培养，每个稀释级做2个平行平皿；细菌用胰酪大豆胨琼脂培养基，30℃~35℃培养3~5天计数；真菌和酵母菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基，20℃~25℃培养5~7天计数；②薄膜过滤法：适用于抑菌性供试品、低污染的供试品，每个滤膜过滤不少于1g或1ml供试品，滤膜贴在培养基表面培养计数。计数规则：选择平均菌落数细菌在30cfu~300cfu、真菌在10cfu~100cfu之间的稀释级计算，乘以稀释倍数得到每克（每毫升）供试品的菌落总数；阴性对照采用稀释液同法操作，菌落总数不得超过1cfu，否则试验无效。5.3控制菌检查法本方法用于检查药品中规定的致病性微生物，常见控制菌包括大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白色念珠菌，所有检查必须符合以下要求：操作流程：供试品增菌培养→分离培养→纯培养→生化/血清学鉴定→结果判断，具体操作按《中国药典》（2020年版）相应项目执行：①大肠埃希菌：取相当于10g/10ml供试品的供试液接种至胰酪大豆胨液体培养基，30℃~35℃增菌18~24小时，转种麦康凯琼脂培养，挑取可疑菌落做IMViC试验，结果为靛基质阳性、甲基红阳性、VP阴性、枸橼酸盐阴性，判定为检出大肠埃希菌；②沙门菌：增菌后转种选择性培养基，挑取可疑菌落做生化鉴定和血清凝集试验，阳性判定为检出；③其他控制菌按相应程序鉴定。对照要求：每次检查必须做阳性菌对照和阴性对照，阳性对照必须长出典型菌落，阴性对照无生长，试验方可生效。5.4细菌内毒素检查法本方法用于检测药品中革兰阴性菌产生的内毒素，分为凝胶法和光度测定法，凝胶法为常用方法。操作要求：每批次鲎试剂必须做灵敏度复核，供试品必须做干扰试验，内毒素回收率在50%~200%之间方可开展检验；试验设置阴性对照（无内毒素水）、灵敏度阳性对照、供试品阳性对照，所有管做平行，37℃±1℃孵育60分钟±2分钟，缓慢取出观察结果，阴性对照不形成凝胶、阳性对照形成凝胶、供试品阳性对照形成凝胶，试验有效。结果判断：供试品所有平行管都不形成凝胶，判定内毒素符合规定；供试品一半及以上平行管形成凝胶，判定内毒素不符合规定。6结果判断、记录与偏差处理6.1结果判断①无菌检查：培养14天，所有培养基均无菌生长，对照符合要求，判定供试品符合无菌规定；任何一管培养基有菌生长，经鉴定排除检验操作污染，判定供试品不符合无菌规定；若怀疑阳性结果为操作污染，可重新取样，取两倍数量供试品复试，所有复试管均无菌生长方可判定合格。②微生物限度检查：细菌总数、真菌酵母菌总数均不超过规定限度，所有控制菌未检出，判定符合规定；任何一项不符合，判定不符合规定。③细菌内毒素检查：内毒素含量不超过规定限值，判定符合规定，否则不符合。6.2记录管理所有检验原始记录必须实时记录，内容包括供试品信息、环境监测结果、培养基批号、设备编号、培养温度、培养时间、原始观察数据、结果，记录不得涂改，如需修改必须划线标注，签字并注明日期；原始记录至少保存至药品有效期后一年，无有效期的至少保存5年；检验报告必须信息完整，结论明确，检验人、复核人、批准人签字盖章。6.3异常结果与偏差处理发现阴性对照长菌、阳性对照不长、结果超出规定等异常情况，立即停止相关操作，隔离供试品与记录，启动偏差调查，从人员操作、环境、培养基、设备、供试品本身逐一排查原因；确认假阳性结果由检验过程污染导致的，可重新取样开展检验；确认结果异常由供试品本身质量问题导致的，按不合格结果出具报告；所有偏差调查过程与结论必须记录归档。7质量控制与生物安全管理7.1室内质量控制每季度开展人员比对试验，不同检验人员对同一样品检验，结果符合率100%为合格；每半年开展设备比对试验，不同设备检验同一样品，结果偏差在允许范围内为合格；每年至少参加1次国家或省级药检