生物制品氟化物测定指南（试行）

生物制品氟化物测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗类、血液制品类、重组蛋白类、抗毒素/抗血清类、细胞治疗类等生物制品的原液、中间品、成品及生产用辅料、工艺用水中游离氟、总氟的测定。本指南为通用技术要求，各品种各论有明确规定的，按各论要求执行。2规范性引用文件《中华人民共和国药典》2025年版三部通则9101《药品质量标准分析方法验证指导原则》、通则0872《氟化物测定法》；GB/T5750.5-2006《生活饮用水标准检验方法无机非金属指标》；GB/T6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》；ISO10993-17-2002《医疗器械生物学评价第17部分：可沥滤物允许限量的建立》；EMA/CHMP/BWP/320436/2016《生物制品质量控制指导原则》。3术语和定义3.1游离氟：生物制品基质中以游离态F⁻存在的氟离子，无需消解可直接通过离子选择电极或离子色谱测定的氟组分。

3.2总氟：生物制品中游离态、络合态及结合于有机分子中的全部氟元素，经消解处理转化为游离F⁻后测定的氟总量。

3.3总离子强度调节缓冲液（TISAB）：用于固定测定体系离子强度、控制pH值、掩蔽干扰离子的混合缓冲溶液，保证氟离子活度与浓度呈线性对应关系。

3.4检出限（LOD）：特定测定方法下可定性检出样品中氟化物的最低浓度，对应3倍空白样品测定值的标准偏差。

3.5定量限（LOQ）：特定测定方法下可准确定量样品中氟化物的最低浓度，对应10倍空白样品测定值的标准偏差。4方法原理及选择原则4.1离子选择电极法（ISE）氟离子选择电极的敏感膜为氟化镧单晶膜，对游离F⁻具有特异性响应。25℃条件下，当测定体系离子强度、pH值固定时，电极电位与试液中F⁻活度的对数符合能斯特方程：E=E0-(2.303RT/F)lgαF-，其中E为电极电位，E0为标准电极电位，R为气体常数（8.314J/(mol·K)），T为热力学温度，F为法拉第常数（96485C/mol），αF-为F⁻活度。通过加入TISAB固定体系离子强度，使活度系数恒定，即可将活度替换为浓度，通过校准曲线定量F⁻浓度。5试剂与材料5.1试验用水符合GB/T6682-2008规定的一级水，电阻率≥18.2MΩ·cm，无氟。

5.2试剂

5.2.1氟化钠（NaF）：优级纯，使用前于120℃鼓风干燥箱中烘干2h，置于干燥器中冷却至室温备用。

5.2.2冰乙酸、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、硝酸、30%过氧化氢：均为优级纯，其中氯化钠使用前需经600℃灼烧4h除氟。

5.2.3三氯乙酸：分析纯，用于蛋白类样品除蛋白。

5.2.4反式-1,2-环己二胺四乙酸（CDTA）：优级纯，用于高铝、高铁基质样品的TISAB配制。

5.2.5离子色谱用淋洗液：碳酸盐体系为1.8mmol/L碳酸钠+1.7mmol/L碳酸氢钠溶液，经0.22μm尼龙滤膜过滤、超声脱气30min后使用；氢氧根体系为20mmol/L氢氧化钾溶液，由淋洗液发生器在线生成。

5.2.6离子色谱抑制器再生液：50mmol/L硫酸溶液，由优级纯浓硫酸稀释配制。

5.3标准溶液配制

5.3.1氟化物标准储备液（100μg/mL，以F⁻计）：准确称取烘干后的氟化钠0.2210g（精确至0.0001g），用少量水溶解后转移至1000mL聚乙烯容量瓶中，定容至刻度，摇匀后转移至聚乙烯瓶中，4℃避光保存，有效期6个月。

5.3.2氟化物标准工作液（10μg/mL）：准确移取10.00mL氟化物标准储备液至100mL聚乙烯容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，临用前配制。

5.3.3氟化物标准工作液（1μg/mL）：准确移取10.00mL10μg/mL氟化物标准工作液至100mL聚乙烯容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，临用前配制。

5.4TISAB配制

5.4.1通用型TISAB（TISABI）：称取58.0g经灼烧除氟的氯化钠、10.0g柠檬酸钠，溶于500mL水中，加入57mL冰乙酸，搅拌均匀后用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.0~5.5，冷却至室温后转移至1000mL聚乙烯容量瓶中，定容至刻度，摇匀，4℃保存，有效期3个月。

5.4.2高抗干扰型TISAB（TISABII）：称取58.0g氯化钠、10.0gCDTA、57mL冰乙酸，溶于500mL水中，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.0~5.5，定容至1000mL，适用于铝含量≥1mg/L、铁含量≥0.5mg/L的样品测定。

5.5材料

所有接触氟化物溶液的容器均为聚乙烯、聚丙烯或聚四氟乙烯材质，禁止使用玻璃容器；新容器使用前用10%（v/v）硝酸溶液浸泡24h，再用一级水冲洗至少6次，晾干后密封备用；配套材料包括0.22μm聚醚砜微孔滤膜、10kD截留分子量超滤离心管、无灰定量滤纸、铂丝、500mL/1000mL石英氧瓶。6仪器设备6.1离子计/酸度计：电位测量精度≥0.1mV，可接入氟离子选择电极及参比电极。

6.2氟离子选择电极、饱和甘汞参比电极（或氟离子复合电极）。

6.3磁力搅拌器：转速可调，配备聚四氟乙烯包覆搅拌子。

6.4离子色谱仪：配备阴离子交换分离柱、电导检测器、自动抑制器、自动进样器。

6.5消解设备：石英氧瓶（配磨口塞及铂丝篮）、微波消解仪（配备聚四氟乙烯消解罐，最高工作温度≥200℃，最高工作压力≥4MPa）。

6.6电子分析天平：分度值0.1mg；高速冷冻离心机：最高转速≥15000r/min，控温范围4℃~25℃；鼓风干燥箱：控温精度±2℃；超纯水仪：出水电阻率≥18.2MΩ·cm。7样品前处理7.1游离氟前处理7.1.1低基质样品：生产用水、工艺缓冲液、无蛋白小分子辅料，准确移取25.0mL样品至50mL聚乙烯容量瓶中，加入25.0mLTISAB，定容至刻度，摇匀待测。

7.1.2蛋白类样品：重组蛋白、血液制品、单抗、抗血清等含蛋白样品，准确移取1.0mL样品至15mL聚乙烯离心管中，加入1.0mL10%（w/v）三氯乙酸溶液，涡旋振荡1min，4℃静置30min后，于4℃、12000r/min离心10min，准确移取1.0mL上清液至10mL聚乙烯容量瓶中，加入5.0mLTISAB，用水定容至刻度，摇匀待测。若样品蛋白浓度≥100mg/mL，采用超滤法除蛋白：准确移取0.5mL样品至10kD截留分子量超滤管中，4℃、8000r/min离心20min，收集超滤液，取0.5mL超滤液按上述方法加入TISAB定容待测。

7.1.3含佐剂疫苗样品：测定游离氟时，准确移取1.0mL疫苗混悬液至15mL聚乙烯离心管中，4℃、15000r/min离心20min，准确移取0.5mL上清液至10mL聚乙烯容量瓶中，加入5.0mLTISAB，定容至刻度，摇匀待测。

7.2总氟前处理

7.2.1氧瓶燃烧法（总氟测定仲裁法）：准确称取0.10.5g液体样品或0.050.2g固体样品（精确至0.0001g），置于折叠好的无灰滤纸中心，将滤纸固定于氧瓶的铂丝篮中，向氧瓶中加入10mL0.5mol/L氢氧化钠吸收液，以流速2L/min向氧瓶中充入高纯氧气2min，立即点燃滤纸尾部，迅速塞紧氧瓶磨口塞，待滤纸完全燃烧后，将氧瓶振荡30min，静置15min后，用少量一级水冲洗瓶塞、铂丝及瓶壁，将冲洗液与吸收液合并转移至50mL聚乙烯容量瓶中，用1mol/L硝酸溶液调节pH至5.0~5.5，加入25mLTISAB，定容至刻度，摇匀待测。同步做空白试验，空白试验除不加样品外，其余操作与样品处理完全一致。

7.2.2微波消解法（适用于无挥发性氟组分的样品）：准确称取0.2~0.5g样品（精确至0.0001g）置于聚四氟乙烯消解罐中，加入5mL优级纯硝酸、2mL30%过氧化氢，加盖后预消解30min，密封消解罐后放入微波消解仪，按以下程序升温：120℃（升温时间5min）保持5min，150℃（升温时间3min）保持5min，180℃（升温时间3min）保持15min。消解完成后自然冷却至室温，打开消解罐，置于140℃赶酸装置上赶酸至溶液剩余约0.5mL（禁止蒸干），冷却后用少量水将消解液转移至50mL聚乙烯容量瓶中，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.0~5.5，加入25mLTISAB，定容至刻度，摇匀待测。同步做空白试验。8测定操作8.1离子选择电极法8.1.1电极活化：新电极或长期未使用的电极，使用前置于10mg/L氟化物标准溶液中活化1h，用一级水冲洗至空白电位≥300mV后方可使用。

8.1.2校准曲线绘制：分别准确移取0、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00mL1μg/mL氟化物标准工作液至50mL聚乙烯容量瓶中，各加入25.0mLTISAB，用水定容至刻度，摇匀，得到氟浓度分别为0、0.002、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2mg/L的标准系列溶液。将标准系列溶液按浓度从低到高依次转移至聚乙烯烧杯中，放入搅拌子，插入氟电极与参比电极，在恒定搅拌速度下测定电位值，待电位稳定（30s内变化≤0.5mV）后记录电位值。以电位值（mV）为纵坐标，氟浓度的常用对数（lgC）为横坐标，绘制校准曲线，进行线性回归，要求回归方程相关系数r≥0.999，25℃条件下斜率应在55~65mV/decade范围内，斜率不符合要求时应更换电极或重新配制试剂。

8.1.3样品测定：将处理好的样品溶液按照与标准系列相同的条件测定电位值，每个样品平行测定2次，记录平均电位值，代入校准曲线回归方程计算样品溶液中的氟浓度。

8.2离子色谱法

8.2.1色谱条件设定：采用阴离子交换色谱柱（如DionexIonPacAS19，4mm×250mm），淋洗液为20mmol/L氢氧化钾溶液，流速1.0mL/min，柱温30℃，抑制器电流50mA，进样体积25μL。

8.2.2校准曲线绘制：分别准确移取适量氟化物标准工作液，用水配制成浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0mg/L的标准系列溶液，过0.22μm滤头后依次进样，记录氟离子峰面积。以峰面积为纵坐标，氟浓度为横坐标，进行线性回归，要求回归方程相关系数r≥0.999。

8.2.3样品测定：将处理好的样品溶液过0.22μm聚醚砜滤头，按上述色谱条件进样测定，记录氟离子峰面积，代入校准曲线回归方程计算样品溶液中的氟浓度。每个样品平行测定2次，取平均值计算。9结果计算与表述9.1计算公式生物制品中氟化物含量（以F⁻计）按下式计算：

式中：

X——样品中氟化物含量，液体样品单位为mg/mL，固体样品单位为mg/g，疫苗按剂计算单位为mg/剂；

C——校准曲线查得的样品测定液中氟浓度，单位为mg/L；

V——样品测定液的定容体积，单位为L；

D——样品前处理过程中的稀释倍数；

m——样品取样量，液体样品单位为mL，固体样品单位为g，疫苗按取样体积换算为剂数。

若测定总氟，需扣除空白试验测得的氟含量。

9.2结果表述

测定结果保留位数与限度要求一致，或保留2位有效数字；测定值低于检出限时，结果表述为“<LOD”，并标注检出限数值。10方法学验证要求10.1检出限与定量限：连续测定11次空白样品，计算空白值的标准偏差（SD），以3SD对应的浓度为方法检出限，10SD对应的浓度为定量限。要求离子选择电极法检出限≤0.01mg/L，定量限≤0.03mg/L；离子色谱法检出限≤0.001mg/L，定量限≤0.003mg/L。

10.2准确度：采用加标回收法验证，分别向空白基质中加入高、中、低3个浓度水平的氟标准溶液（低浓度为定量限浓度，中浓度为限度值的50%，高浓度为限度值的120%），每个浓度水平平行制备6份样品，按规定方法测定，计算加标回收率，要求回收率范围为85%~115%。

10.3精密度：同一分析人员同一条件下对同一批次样品平行测定6次，重复性RSD≤10%；不同分析人员不同日期、不同仪器对同一批次样品测定，中间精密度RSD≤15%。

10.4专属性：考察生物制品中常见共存组分（氯离子、硫酸根、磷酸根、醋酸根、枸橼酸根、蔗糖、吐温80、明胶、铝佐剂、铁离子等）的干扰，加入上述组分后加标回收率应在80%~120%范围内，证明无显著干扰。

10.5线性范围：离子选择电极法线性范围为0.01mg/L10mg/L，离子色谱法线性范围为0.001mg/L20mg/L，范围内相关系数r≥0.999。

10.6稳定性：处理后的样品溶液4℃放置24h，测定结果RSD≤10%，证明样品处理后24h内稳定。11测定质量控制11.1空白控制：每批次测定至少做2份全程序空白，空白测定值应低于方法检出限，若空白值偏高，应排查容器污染、试剂含氟、试验用水不合格等问题，排除后方可继续测定。

11.2校准曲线控制：每次测定需同步绘制校准曲线，相关系数≥0.999；若连续测定样品数量≥20个，每测定10个样品后插入1份中间浓度质控样，质控样测定值与理论值的相对偏差≤10%，否则需重新绘制校准曲线。

11.3平行样控制：每个样品至少做2份平行测定，平行样测定结果的相对偏差≤10%，否则需重新测定。

11.4回收控制：每批次测定至少带1份加标回收样品，加标回收率应在80%~120%范围内，否则该批次样品测定结果无效，需重新处理测定。12注意事项12.1污染防控：所有接触氟化物的容器禁止使用玻璃材质，避免玻璃中的硅与氟反应吸附氟离子；测定区域禁止使用含氟清洁剂（如牙膏、含氟洗洁精），操作人员需佩戴无粉乳胶或丁腈手套，避免皮肤接触样品引入污染。

12.2pH控制：氟离子选择电极测定的最佳pH范围为5.0~5.5，pH<5时H⁺与F⁻结合生成HF或HF₂⁻导致结果偏低，pH>5.5时OH⁻与氟化镧膜反应释放F⁻导致结果偏高，必须通过TISAB严格控制pH在规定范围内。

12.3干扰消除：铝、铁、锆等高价金属离子可与F⁻形成稳定络合物导致结果偏低，若样品中铝含量≥1mg/L、铁含量≥0.5mg/L，需使用TISABII消除干扰。

12.4消解控制：氧瓶燃烧法需保证样品完全燃烧，瓶内无黑色残渣，否则需重新取样；微波消解法赶酸温度不得超过160℃，避免氟以HF形式挥发损失，禁止将消解