生物制品钾盐测定指南（试行）

生物制品钾盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗类、抗毒素/抗血清类、血液制品类、重组蛋白/多肽类、细胞与基因治疗类生物制品的原液、中间品、成品及配套药用辅料中钾盐（以氯化钾计）的定量测定，其他生物相关样品的钾盐测定可参照执行。本指南包含火焰原子吸收分光光度法（仲裁法）、电感耦合等离子体发射光谱法两类测定方法，各单位可根据样品基质特性、检测通量需求选择适配方法，若测定结果存在争议，以火焰原子吸收分光光度法结果为准。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0406原子吸收分光光度法、通则0411电感耦合等离子体发射光谱法GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T27417-2017合格评定化学分析方法确认和验证指南《药品生产质量管理规范（2010年修订）》生物制品附录3术语和定义3.1待测液：指样品经前处理、定容后待上机测定的均相溶液。3.2样品空白：指不加供试品，其余按照与样品完全相同的前处理、定容步骤制备得到的溶液，用于扣除试剂、耗材引入的钾背景值。3.3检出限（LOD）：指特定测定方法下，可定性检出样品中钾元素的最低浓度，对应11次平行测定空白溶液标准偏差的3倍值。3.4定量限（LOQ）：指特定测定方法下，可准确定量样品中钾元素的最低浓度，对应11次平行测定空白溶液标准偏差的10倍值，定量限水平的加标回收率需满足90%~110%要求。3.5基质效应：指样品中除待测物外的其他基质组分对待测物测定响应的干扰效应，可导致测定结果偏高或偏低。4基本要求4.1人员要求所有参与钾盐测定的人员需经原子吸收分光光度法/电感耦合等离子体发射光谱法操作理论与实操培训、生物安全操作培训，考核合格后上岗；涉及高生物安全风险样品（含活病原体、活细胞的样品）的前处理操作，操作人员需具备对应生物安全级别的操作资质。4.2试剂与耗材要求4.2.1实验用水：符合GB/T6682-2008规定的一级水，电阻率≥18.2MΩ·cm（25℃）。4.2.2标准物质：钾元素标准储备液为有证标准物质，标准值不确定度≤1%，浓度为1000mg/L，开封后有效期按照证书规定执行，无明确规定的冷藏保存有效期为6个月；钾标准中间液由储备液用1%硝酸溶液逐级稀释制备，浓度为100mg/L，冷藏保存有效期为1个月。4.2.3试剂：硝酸为优级纯及以上级别，30%过氧化氢为优级纯，氯化铯为优级纯；10g/L氯化铯溶液的配制：称取1.0g氯化铯，用1%硝酸溶液溶解并定容至100ml，冷藏保存有效期为3个月；1%硝酸溶液的配制：量取1ml优级纯硝酸，缓慢加入99ml一级水中，混匀后现用现配。4.2.4耗材：所有接触样品、试剂的聚四氟乙烯消解罐、聚乙烯容量瓶、聚乙烯离心管、移液枪头均需置于10%（v/v）硝酸溶液中浸泡≥24h，取出后用一级水冲洗至少6次，晾干后密封保存备用；禁止使用玻璃容量瓶长期盛放含钾溶液，避免玻璃中钾溶出干扰测定。4.3仪器与设备要求4.3.1测定仪器：火焰原子吸收分光光度计（配备钾元素空心阴极灯、空气-乙炔火焰系统）、电感耦合等离子体发射光谱仪，仪器需经法定计量部门校准合格并在有效期内使用。4.3.2前处理设备：微波消解仪（配备压力、温度监控系统，每半年校准一次温度、压力参数）、石墨赶酸仪（温度控制精度±5℃）、万分之一及以上精度电子天平（每年校准一次）、离心机（最大转速≥10000r/min）、恒温水浴锅、二级生物安全柜。4.3.3仪器校准：每次测定前需对仪器的波长准确度、空心阴极灯能量进行校准，火焰原子吸收分光光度计需调整燃烧头高度、燃气流量至最佳测定状态；电感耦合等离子体发射光谱仪需进行炬管位置校准、雾化器效率调试。5测定方法5.1样品前处理根据样品基质复杂度选择适配的前处理方法，所有前处理操作需同步制备样品空白。5.1.1直接稀释法适用范围：基质简单、蛋白/脂质/佐剂含量≤0.1%（w/v）的样品，包括透析后中间品、缓冲液、药用级辅料溶液、低浓度蛋白原液。操作步骤：准确量取1.0~5.0ml（精确至0.01ml）充分混匀的样品至25ml聚乙烯容量瓶中，加入1.0ml10g/L氯化铯溶液（ICP-OES法可省略），用1%硝酸溶液定容至刻度，充分混匀；若定容后溶液出现浑浊，以10000r/min离心5min，取上清液作为待测液。5.1.2湿法消解法适用范围：基质中等复杂度、蛋白含量≤10%（w/v）、无佐剂/脂质成分的样品，包括重组蛋白成品、血液制品中间品、无佐剂疫苗。操作步骤：准确称取0.5~2.0g（精确至0.0001g）样品至聚四氟乙烯消解管中，加入5.0ml优级纯硝酸，盖塞后静置预消解1h；将消解管置于赶酸仪上，120℃加热消解30min，待棕色烟挥发完全后，加入2.0ml30%过氧化氢，升温至150℃继续加热，直至溶液澄清无色、无明显沉淀物，继续赶酸至溶液剩余0.5~1.0ml；停止加热，冷却至室温后，用1%硝酸溶液将消解液转移至25ml聚乙烯容量瓶中，加入1.0ml10g/L氯化铯溶液（ICP-OES法可省略），定容至刻度，充分混匀后作为待测液。5.1.3微波消解法适用范围：基质复杂度高、含佐剂/脂质/高浓度蛋白的样品，包括含铝佐剂疫苗、脂质体药物、细胞裂解液、全血来源生物制品、冻干成品。操作步骤：准确称取0.2~1.0g（精确至0.0001g）充分混匀的样品至微波消解内罐中，含活病原体/活细胞的样品需先经121℃高压灭菌20min灭活后取样；加入5.0ml优级纯硝酸、2.0ml30%过氧化氢，盖紧内罐后装入消解外罐，按照以下程序进行消解：阶段1：升温速率10℃/min，升温至120℃，保持5min；阶段2：升温速率8℃/min，升温至160℃，保持10min；阶段3：升温速率5℃/min，升温至190℃，保持20min；消解结束后待内罐温度冷却至室温，取出内罐置于赶酸仪上，140℃赶酸至溶液剩余约1ml；冷却后转移至25ml聚乙烯容量瓶，加入1.0ml10g/L氯化铯溶液（ICP-OES法可省略），1%硝酸溶液定容至刻度，混匀后作为待测液。5.2火焰原子吸收分光光度法（仲裁法）5.2.1仪器参数设置：钾元素分析线766.5nm，灯电流3~5mA，狭缝宽度0.5nm，火焰类型为空气-乙炔富燃火焰，空气流量6.5L/min，乙炔流量1.3L/min，燃烧头高度7mm，积分时间3s。5.2.2标准曲线制备：分别量取0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0ml100mg/L钾标准中间液至25ml聚乙烯容量瓶中，各加入1.0ml10g/L氯化铯溶液，用1%硝酸溶液定容至刻度，得到钾浓度分别为0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mg/L的标准系列溶液；以钾浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，要求标准曲线线性相关系数r≥0.999。5.2.3样品测定：按照仪器操作规程启动仪器，待基线稳定后，先测定样品空白，再依次测定标准系列溶液、待测液；每个样品平行测定3次，取平均值；若待测液钾浓度超出标准曲线线性范围，需用1%硝酸溶液（含0.4g/L氯化铯）稀释后重新测定，稀释倍数f记录完整。5.3电感耦合等离子体发射光谱法5.3.1仪器参数设置：射频功率1200W，等离子体气流量15L/min，辅助气流量0.5L/min，雾化气流量0.8L/min，观测方向为轴向观测，分析线选择766.5nm（无基质干扰时）或404.4nm（高钠基质时），内标元素选择钇（Y，371.0nm），内标液浓度为1mg/L。5.3.2标准曲线制备：分别量取0、0.1、0.5、2.0、5.0、10.0ml100mg/L钾标准中间液至100ml聚乙烯容量瓶中，用1%硝酸溶液定容至刻度，得到钾浓度分别为0、0.1、0.5、2.0、5.0、10.0mg/L的标准系列溶液（可根据样品实际含量调整线性范围）；以钾浓度为横坐标，发射强度与内标发射强度的比值为纵坐标，绘制标准曲线，要求标准曲线线性相关系数r≥0.9995。5.3.3样品测定：仪器基线稳定后，先测定样品空白，再依次测定标准系列溶液、待测液；每个样品平行测定2次，相对标准偏差（RSD）≤2%为合格，超出范围需重新测定；若存在明显基质效应，需采用基质匹配标准曲线法或标准加入法进行定量。6结果计算6.1钾元素含量计算液体样品（按体积取样）中钾元素质量浓度ρ（单位：mg/L）按式（1）计算：ρ=(ρ测-ρ空白)×V×f/V样（1）式中：ρ测——待测液中钾元素的实测浓度，mg/L；ρ空白——样品空白中钾元素的实测浓度，mg/L；V——待测液定容体积，ml；f——待测液上机前的稀释倍数；V样——取样体积，ml。固体/半固体样品（按质量取样）中钾元素质量分数ω（单位：mg/kg）按式（2）计算：ω=(ρ测-ρ空白)×V×f×1000/m（2）式中：m——取样质量，g；其余参数含义同式（1）。6.2钾盐（以氯化钾计）含量计算钾元素与氯化钾的换算系数为74.55/39.10≈1.907，钾盐含量ρ_KCl（单位：mg/L）或ω_KCl（单位：mg/kg）按式（3）计算：ρ_KCl（或ω_KCl）=ρ（或ω）×1.907（3）6.3结果判定：测定结果保留3位有效数字，若测定结果低于定量限，表述为“小于定量限值+单位”。7方法学验证要求首次采用本指南方法进行样品测定前，或样品基质发生变更、仪器设备发生重大维修后，需按照GB/T27417-2017要求进行方法学验证，验证内容及合格标准如下：7.1专属性：取6份不含钾的空白基质，按照样品前处理方法操作后测定，响应值应低于方法检出限；向空白基质中加入定量限水平的钾标准溶液，加标回收率应在90%~110%范围内，证明无基质干扰。7.2检出限与定量限：连续测定11份样品空白，计算钾元素测定值的标准偏差SD，LOD=3×SD，LOQ=10×SD；要求火焰原子吸收法LOD≤0.05mg/L，LOQ≤0.2mg/L；电感耦合等离子体发射光谱法LOD≤0.01mg/L，LOQ≤0.05mg/L。7.3线性与范围：标准曲线相关系数符合5.2.2、5.3.2要求，线性范围内最高、最低浓度点的实测值与理论值偏差≤5%；线性范围应覆盖样品中钾盐的预期含量范围。7.4精密度：重复性：取同一批次样品平行制备6份待测液，测定结果的RSD≤5%；中间精密度：由2名不同操作人员，在不同日期采用不同仪器分别制备6份待测液，测定结果的RSD≤8%。7.5准确度：采用加标回收法验证，分别向样品中加入低、中、高3个浓度水平的钾标准溶液（加标后浓度分别为定量限、线性范围中点、80%线性上限），每个浓度水平制备3份平行样，加标回收率应在90%~110%范围内；含铝佐剂、高浓度脂质的复杂基质样品，回收率可放宽至85%~115%，RSD≤5%。7.6稳定性：取同一份待测液，分别在0、2、4、8、24h于室温下测定，测定值与0h测定值的相对偏差≤5%，证明待测液室温下24h内稳定；4℃条件下保存7d的测定值与0h偏差≤7%。8质量控制要求每批次样品测定需同步开展以下质量控制措施，不符合要求的批次测定结果无效，需重新测定：8.1空白控制：样品空白的钾测定值应低于方法定量限，若超出限值，说明试剂、耗材存在污染，需更换试剂或重新处理耗材后测定。8.2标准曲线控制：标准曲线测定完成后，回测线性范围内的中间浓度标准点，实测值与理论值的相对偏差≤3%。8.3质控样控制：每测定10份样品，插入1次有证标准物质或实验室内部质控样，质控样测定值与标示值的相对偏差≤10%。8.4平行样控制：每批次样品随机抽取10%的样品进行平行样测定，平行样测定结果的RSD≤5%；样品数不足10份的，至少做1份平行样。9注意事项与异常处理9.1污染防控：钾元素广泛存在于环境、人体汗液中，操作过程需全程佩戴无粉丁腈手套，避免用手直接接触器皿内壁、样品；实验区域避免扬尘，禁止在测定区域摆放含钾的化学试剂、玻璃制品。9.2电离干扰控制：火焰原子吸收法测定时，需保证待测液中氯化铯终浓度≥0.4g/L；若样品中钠浓度≥100mg/L，需将氯化铯终浓度提高至1g/L，完全抑制钾的电离干扰。9.3基质效应处理：高基质样品测定时，优先采用微波消解法处理，若采用直接稀释法，需使用空白基质配制标准曲线，消除基质效应；若回收率不符合要求，可采用标准加入法进行定量。9.4生物安全控制：高生物安全风险样品的取样、灭活操作需在对应级别的生物安全柜中进行，产生的废弃物需经高压灭菌后处置。9.5异常情况处理9.5.1标准曲线线性不合格：排查标准溶液是否过期、器皿是否污染、仪器波长是否校准，重新配制标准溶液测定。9.5.2回收率偏低：排查前处理过程是否存在消解不完全、赶酸时溶液溅出、雾化器堵塞等问题，优化前处理参数或清洗仪器后重新测定。9.