生物制品氯化物测定指南（试行）

生物制品氯化物测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗类、抗毒素/抗血清类、血液制品类、重组蛋白/抗体类、细胞治疗产品、基因治疗产品及相关原辅材料（包括生产用缓冲液、培养基、赋形剂）等生物制品中氯化物（以Cl⁻或NaCl计）的定量测定，涵盖原液、半成品、成品全生产流程的质量控制检测。本指南包含3种测定方法，其中硝酸银电位滴定法适用于氯化物含量≥0.01%（质量分数，下同）或≥100mg/L的样品，尤其适用于基质复杂、含色素、佐剂、高浓度蛋白的样品；比浊法适用于氯化物含量为0.001%0.01%（即10mg/L100mg/L）、基质澄清无明显干扰物的样品；离子色谱法适用于氯化物含量≤0.001%（即≤10mg/L）、需排除其他阴离子干扰的微量检测场景。对于含高浓度溴化物、碘化物、硫化物且未进行干扰消除处理的样品，不适用比浊法和电位滴定法直接测定，需采用离子色谱法经色谱柱分离后定量。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。

《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0301氯化物测定法

GB/T601-2016化学试剂标准滴定溶液的制备

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27417-2017合格评定化学分析方法确认和验证指南

《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》（2025年版）

3术语和定义

3.1总氯化物：指样品中以游离态Cl⁻形式存在的氯化物总量，结果可根据需求以Cl⁻或NaCl计，两者换算系数为1.6485（即1mgCl⁻相当于1.6485mgNaCl）。

3.2基质效应：样品中除目标物外的其他组分对测定结果的干扰效应，包括增强效应和抑制效应。

3.3等当点：电位滴定过程中，标准滴定液与待测物的反应达到化学计量比时的反应点，对应电位突变的峰值位置。

3.4空白校正：扣除试剂、器皿、前处理过程引入的氯化本底的操作。

4通用要求

4.1试剂与材料

4.1.1实验用水：符合GB/T6682规定的一级水要求，电阻率≥18.2MΩ·cm，且经检测无氯化物本底干扰。

4.1.2试剂级别：所有化学试剂需为优级纯及以上级别，基准物质需采用国家有证标准物质。

4.1.3标准物质：基准氯化钠需经270℃干燥至恒重后使用，硝酸银标准滴定溶液的标定需严格按照GB/T601执行，低浓度标准使用液需现用现配。

4.1.4耗材：所有接触样品的玻璃器皿、塑料离心管、比色管、滤膜等，需预先用10%（v/v）优级纯硝酸浸泡24h，再用一级水冲洗至少6次，晾干后密封保存，避免环境中含氯消毒剂（如次氯酸钠、84消毒液）污染。

4.2仪器设备

4.2.1电位滴定系统：配备银离子选择性电极、双盐桥参比电极（外盐桥填充饱和硝酸钾溶液）、磁力搅拌装置，电位分辨率≤0.1mV。电极使用前需用抛光布打磨表面氧化层，再用一级水活化30min，每次测定后用10%硝酸浸泡1min去除附着的氯化银沉淀。

4.2.2比浊法检测设备：紫外可见分光光度计或浊度计，配备1cm石英比色皿，波长准确度≤±2nm。

4.2.3离子色谱系统：配备阴离子交换柱、抑制型电导检测器、自动进样器，系统压力稳定性≤0.1MPa，电导检测池温度控制精度≤±0.1℃。

4.2.4其他设备：分析天平（精度0.0001g）、高速离心机（最大转速≥10000r/min）、恒温水浴锅、高压灭菌设备、0.22μm/0.45μm水系滤膜、固相萃取小柱（C18柱、Ag柱、H柱）。

4.3样品采集与保存

4.3.1取样：按照生物制品取样规程执行，无菌操作，避免样品被含氯消毒剂、手套粉等污染，每份样品取样量不少于20ml（或20g），平行样品需同批次同条件取样。

4.3.2保存：待检样品需按照产品规定的储存条件暂存，2~8℃避光保存，24h内完成测定；若需长期保存，需预先验证储存条件下氯化物的稳定性，避免样品降解或容器吸附导致结果偏差。含活微生物、活细胞的样品需先经121℃高压灭菌15min或加硝酸煮沸灭活后再进行前处理，防范生物安全风险。

5测定方法

5.1第一法硝酸银电位滴定法

5.1.1方法原理

在酸性条件下（pH1~2），硝酸银与样品中的Cl⁻反应生成溶解度极低的氯化银沉淀，滴定至等当点时，溶液中银离子浓度发生突变，银电极电位出现突跃，根据消耗的硝酸银标准滴定溶液体积计算氯化物含量。该方法不受样品颜色、浊度干扰，准确度高，是氯化物测定的仲裁方法。

5.1.2试剂配制

（1）1+1硝酸溶液：取优级纯浓硝酸与等体积一级水混合，加热煮沸5min去除溶液中溶解的氮氧化物，冷却后密封保存，避免引入氯本底。

（2）硝酸银标准滴定溶液（0.1mol/L）：称取17.5g硝酸银溶于1000ml一级水中，摇匀后置于棕色试剂瓶中避光保存，按照附录A的方法标定浓度。若测定低浓度样品，可将0.1mol/L标准液用无氯一级水稀释为0.01mol/L使用，现用现标。

5.1.3样品前处理

根据样品基质类型选择对应的前处理方法：

（1）低蛋白/无蛋白样品：如缓冲液、透析液、多糖制品等，直接量取一定体积样品（V样，单位ml，含Cl⁻≥0.05mmol）置于滴定杯中。

（2）高蛋白样品：如人血白蛋白、重组抗体、抗血清等，蛋白浓度≥1mg/ml时，量取V样（5~10ml），加入等体积10%（m/v）钨酸钠溶液，摇匀后加入2倍体积0.33mol/L优级纯硫酸溶液，充分振荡后静置10min，4000r/min离心10min，全部转移上清液至滴定杯中。也可采用三氯乙酸沉淀法：加入等体积20%（m/v）三氯乙酸溶液，摇匀后静置5min，离心取上清液。

（3）含铝/钙佐剂疫苗样品：量取V样（5~10ml），加入5ml1+1硝酸溶液，加热煮沸至佐剂完全溶解，冷却后转移至滴定杯中，若有不溶杂质，采用定量滤纸过滤后收集滤液。

（4）固体制剂：如冻干粉针剂、原料药等，精确称取W样（单位g，精确至0.0001g），用适量一级水溶解后转移至滴定杯中。

5.1.4测定步骤

向滴定杯中的样品处理液中加入5ml1+1硝酸溶液，补加一级水至总体积约50ml，确保溶液pH在1~2范围内（可通过pH试纸验证，若pH偏高需补加硝酸调整），放入磁力搅拌子，插入银电极和双盐桥参比电极，开启搅拌（转速以不产生气泡为宜）。待电位稳定后，用硝酸银标准滴定溶液滴定，采用动态滴定模式，电位突变超过50mV时判定为终点，记录消耗的硝酸银体积V1（单位ml）。同法做空白试验，记录空白消耗体积V0（单位ml）。

5.1.5结果计算

液体样品氯化物含量（以NaCl计，%）计算公式：

式中：

C为硝酸银标准滴定溶液的浓度，单位mol/L；

58.44为NaCl的摩尔质量，单位g/mol；

ρ为样品的密度，单位g/ml，液态生物制品密度近似为1g/ml时可直接代入1计算；

固体制剂氯化物含量（以NaCl计，%）计算公式：

式中W样为样品称样量，单位g。

5.1.6方法学要求

本方法回收率为95%~105%，重复性相对标准偏差（RSD，n=6）≤2.0%，检出限为0.005%，定量限为0.01%，平行样相对偏差≤2.0%。

5.2第二法比浊法

5.2.1方法原理

在酸性硝酸介质中，Cl⁻与硝酸银反应生成氯化银胶体微粒，加入胶体保护剂（聚乙烯醇或明胶）防止沉淀聚集，在一定浓度范围内，悬浮液的浊度与Cl⁻含量成正比，于530nm波长处测定吸光度，与标准系列比较定量。该方法操作简便、检测速度快，适合批量样品筛查。

5.2.2试剂配制

（1）硝酸银-硝酸溶液：称取1.0g优级纯硝酸银溶于100ml10%（v/v）硝酸溶液中，摇匀后置于棕色瓶中避光保存，若出现浑浊需弃用重配。

（2）1%（m/v）聚乙烯醇溶液：称取1.0g聚乙烯醇（聚合度1750±50）溶于100ml沸水中，冷却后过滤，密封保存，有效期1个月。

（3）氯化物标准储备液（500μg/mlCl⁻）：精确称取270℃干燥至恒重的基准氯化钠0.8242g，溶于一级水后定容至1000ml，摇匀后置于4℃保存，有效期6个月。

（4）氯化物标准使用液（10μg/mlCl⁻）：临用前将标准储备液用一级水稀释得到。

5.2.3样品前处理

按照5.1.3的方法进行前处理，处理后的上清液需澄清透明，若有浑浊需经0.45μm水系滤膜过滤，弃去初滤液后收集续滤液待测。

5.2.4标准曲线制备

分别量取0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0ml氯化物标准使用液置于25ml具塞比色管中，对应Cl⁻含量为0、2、5、10、20、30、50μg。向各管中加入1ml1%聚乙烯醇溶液，摇匀后加入2ml硝酸银-硝酸溶液，用一级水定容至刻度，充分摇匀后避光放置15min。于530nm波长处，用1cm石英比色皿，以0管为空白测定吸光度，以吸光度为纵坐标、Cl⁻含量为横坐标绘制标准曲线，线性相关系数需≥0.999。

5.2.5样品测定

量取适量处理后的样品液（含Cl⁻在2~50μg范围内）置于25ml具塞比色管中，按照与标准系列相同的步骤操作，测定吸光度，从标准曲线中查得样品中Cl⁻的质量m（单位μg）。

5.2.6结果计算

样品氯化物含量（以Cl⁻计，mg/L）计算公式：

式中：

f为样品前处理的稀释倍数；

V样为取样体积，单位ml。

若需以NaCl计，结果乘以换算系数1.6485即可。

5.2.7方法学要求

本方法回收率为90%~110%，重复性RSD（n=6）≤5.0%，检出限为0.1mg/L，定量限为0.3mg/L，平行样相对偏差≤5.0%。若样品中含溴化物、碘化物、硫化物、氰化物等可与银离子生成沉淀的物质，会产生正干扰，需预先去除干扰或换用其他方法。

5.3第三法离子色谱法

5.3.1方法原理

样品经前处理去除蛋白、有机物等杂质后，进入离子色谱系统，通过阴离子交换色谱柱将Cl⁻与其他阴离子分离，经抑制型电导检测器检测，根据保留时间定性、峰面积定量。该方法专属性强、灵敏度高，可同时排除其他阴离子的干扰，是微量氯化物测定的首选方法。

5.3.2试剂配制

（1）淋洗液：根据色谱柱类型选择，碳酸盐体系淋洗液为3.2mmol/L碳酸钠+1.0mmol/L碳酸氢钠混合溶液，经0.22μm滤膜过滤并超声脱气后使用；氢氧根体系淋洗液为20mmol/L氢氧化钾溶液，采用淋洗液在线发生器生成时无需手动配制。

（2）氯化物标准储备液同5.2.2（3），系列标准工作液浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0mg/LCl⁻，临用前用一级水稀释配制。

5.3.3样品前处理

（1）除蛋白处理：高蛋白样品采用10kDa超滤管离心超滤，4000r/min离心20min，收集超滤液；或采用固相萃取H柱去除蛋白和阳离子杂质。

（2）除有机物处理：含高浓度多糖、脂类、防腐剂的样品，先经C18固相萃取小柱富集去除有机物，上样前C18柱需依次用5ml甲醇、10ml一级水活化，弃去前3ml流出液，收集续滤液。

（3）过滤：处理后的样品经0.22μm水系滤膜过滤，弃去初滤液后收集续滤液待测。

5.3.4色谱条件

参考条件：阴离子分析柱（柱容量≥100μeq），柱温30℃，淋洗液流速1.0ml/min，进样体积25μl，抑制器电流50mA，检测器温度35℃。可根据仪器型号、色谱柱规格对参数进行优化，确保Cl⁻峰与相邻杂峰的分离度≥1.5，拖尾因子在0.9~1.1之间。

5.3.5标准曲线制备

将系列标准工作液依次进样，记录色谱图，以峰面积为纵坐标、Cl⁻浓度为横坐标绘制标准曲线，线性相关系数需≥0.9995。

5.3.6样品测定

将处理后的样品液进样，记录保留时间和峰面积，若样品浓度超出线性范围，需用一级水稀释后重新测定。根据外标法计算样品中Cl⁻的浓度C（单位mg/L）。

5.3.7结果计算

固体制剂氯化物含量（以Cl⁻计，mg/kg）计算公式：

式中：

V为样品定容体积，单位L；

f为稀释倍数；

W样为样品称样量，单位kg。

液体样品氯化物含量（以Cl⁻计，mg/L）计算公式：

5.3.8方法学要求

本方法回收率为92%~108%，重复性RSD（n=6）≤3.0%，检出限为0.001mg/L，定量限为0.003mg/L，平行样相对偏差≤3.0%。若样品中含高浓度硫酸根、硝酸根，需采用梯度淋洗程序分离，避免峰重叠干扰。

6质量控制要求

6.1空白控制：每批次测定（≤20个样品）需同步做2份试剂空白，空白中氯化物含量不得超过方法定量限，若空白超出范围，说明试剂、器皿或环境存在污染，需排查原因并重新处理后再测定。

6.2平行样控制：每个样品需做2份平行样，平行样相对偏差需符合对应方法的要求，若超出偏差范围，需重新取样测定。

6.3质控样控制：每批次测定需同步测定12份有证标准物质或内部质控样，质控样测定值需在标示值的90%110%范围内，否则该批次所有样品结果无效，需重新测定。

6.4标准曲线核查：每测定10个样品需测定1次标准曲线中间浓度点，测定值与理论值的偏差需≤5%，否则需重新绘制标准曲线。

6.5方法验证要求：实验室首次使用本指南中的方法、更换仪器设备、试剂批次或样品基质发生重大变化时，需按照GB/T27417的要求进行方法验证，验证内容包括专属性、准确度、精密度、线性范围、检出限、定量限、耐用性，符合要求后方可用于样品检测。

7偏差与异常结果处理

7.1偏差调查：出现以下情况时需启动偏差调查：平行样偏差超出阈值、空白值过高、质控样结果超出范围、测定结果超出产品标准限度范围。调查内容包括：试剂是否过期或被污染、器皿是否按要求浸泡清洗、电极/色谱柱是否老化或污染、样品前处理操作是否规范、样品是否被污染或变质。

7.2复测要求：若偏差由操作失误、试剂污染等可纠正因素导致，纠正后重新测定样品；若偏差原因不明，需重新抽取同批次样品复测，复测需采用两种不同方法交叉验证，最终结果以仲裁法（电位滴定法）或离子色谱法的结果为准。

7.3结果上报：异常结果需记录偏差调查全过程，经质量负责人审核后方可上报，不得随意修改原始数据。

8注意事项

8.1污染防控：实验区域不得使用含氯消毒剂进行清洁，实验人员不得佩戴涂有滑石粉的手套，所有操作需在无氯环境中进行，避免环境中氯离子污染样品。硝酸银标准溶液需避光保存，每次使用前需检查是否有沉淀生成，若有沉淀需过滤或重新配制。

8.2干扰消除：电位滴定法检测含硫化物的样品时，需先加入3ml30%过氧化氢溶液，加热煮沸5min将硫化物氧化为硫酸盐，消除干扰；比浊法检测有