生物制品锰盐测定指南（试行）

生物制品锰盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗、抗毒素、抗血清、血液制品、重组蛋白制品、基因治疗产品、细胞治疗产品、生化类生物制品及其生产用原材料、辅料中锰盐（以锰元素计）的定性限量检查与定量测定。对于基质成分复杂、存在特殊干扰的生物制品样品，应在使用本指南前开展方法学适用性验证，确认无明显干扰后方可使用。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0406原子吸收分光光度法、通则0411电感耦合等离子体发射光谱法、通则0412电感耦合等离子体质谱法；GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法；GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测；JJG694原子吸收分光光度计检定规程；JJG768发射光谱仪检定规程；JJG1159电感耦合等离子体质谱仪检定规程。3术语和定义3.1锰盐总量：指生物制品基质中以游离态、络合态、结合态存在的所有锰元素的总质量，以Mn计，单位通常为μg/g（固体样品）或μg/mL（液体样品）。3.2检出限（LOD）：指特定方法可定性检出样品中锰的最低浓度，对应3倍空白样品测定值的标准偏差。3.3定量限（LOQ）：指特定方法可准确定量样品中锰的最低浓度，对应10倍空白样品测定值的标准偏差。3.4基质效应：指样品中除待测物外的其他基质成分对待测物测定信号的增强或抑制作用，通常通过溶剂校准曲线与基质匹配校准曲线的斜率比值评估，比值在0.8~1.2范围内为基质效应可接受。3.5基质匹配校准曲线：指采用与待测样品基质组成一致、经过相同前处理流程的空白基质溶液配制的系列浓度标准溶液建立的校准曲线，用于消除基质效应干扰。4方法选择原则4.1快速合规筛查：对于仅需判定锰盐是否符合限度要求、无需准确定量的样品，优先选择目视比色法，该方法操作简便、无需大型仪器，适合现场或基层实验室快速筛查。4.2痕量定量检测：对于锰含量预计在0.01μg/L~100μg/L的多数疫苗、重组蛋白制品、血液制品样品，优先选择石墨炉原子吸收分光光度法（GFAAS），该方法灵敏度高、成本适中，适合常规质量控制检测。4.3多元素同步检测：对于需同时测定包括锰在内的多种金属元素残留的样品，且锰含量预计在10μg/L~1000μg/L范围内的，选择电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES），该方法检测效率高、线性范围宽。4.4超痕量检测与仲裁：对于锰含量预计低于0.01μg/L的mRNA疫苗、细胞治疗产品、寡核苷酸类生物制品，或需对争议结果进行仲裁的，选择电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS），该方法灵敏度最高、抗干扰能力强，为法定仲裁方法。4.5方法冲突处理：若本指南规定方法与对应生物制品的注册标准、法定质量标准存在冲突，以法定标准规定的方法为准。5通用要求5.1试验环境试验区域需独立设置，与其他金属检测、化学合成区域物理隔离，避免交叉污染。试验台采用耐酸碱、无金属析出的聚丙烯或聚四氟乙烯台面，每次试验前用0.5%硝酸溶液擦拭台面。试验人员需佩戴无粉乳胶手套、穿洁净工作服，避免皮肤直接接触样品、试剂及器皿内壁。5.2器皿要求所有接触样品、试剂的容器需采用聚丙烯（PP）、聚四氟乙烯（PTFE）材质，禁止使用普通玻璃器皿（含锰元素易析出导致本底升高）。使用前需将器皿置于20%（v/v）优级纯硝酸溶液中浸泡至少24h，取出后用符合GB/T6682要求的一级水冲洗至少3次，置于洁净的防尘柜中晾干备用，禁止使用铬酸洗液洗涤器皿，避免引入铬元素干扰及外源性锰污染。5.3试剂与标准品5.3.1试验用水：符合GB/T6682要求的一级水，电阻率≥18.2MΩ·cm，每批次用水需检测锰本底，含量不得低于对应方法的检出限。5.3.2酸试剂：消解用硝酸为电子级，比色法用酸为优级纯，每批次酸试剂需做空白试验，锰含量不得超过对应方法的检出限。5.3.3标准品：采用国家法定计量机构颁发的锰单元素标准溶液，浓度为1000μg/mL，有效期参照标准物质证书执行。标准中间液用0.5%硝酸稀释为1μg/mL，于4℃避光保存，有效期1个月；标准工作液需临用前新鲜配制。5.4样品前处理通用要求5.4.1取样要求：液体样品需摇匀后精密量取，冻干制剂需按说明书规定的复溶溶剂和方法完全复溶后取样，固体样品需研磨均匀后精密称取。取样量根据预计锰含量调整，确保最终测定值处于校准曲线线性范围内，避免超出线性范围导致结果偏差。5.4.2样品前处理方法5.4.2.1微波消解法（首选方法）精密称取固体供试品0.2~2g或量取液体供试品1~5mL，置于聚四氟乙烯微波消解罐内，加入电子级硝酸5~8mL、30%优级纯过氧化氢1~2mL，加盖后静置30min预消解，避免反应过于剧烈导致泄压。密封消解罐后置于微波消解仪中，按照表1的升温程序进行消解。消解完成后待消解罐温度降至室温，取出置于通风橱内缓慢开罐，将消解罐置于100℃电热板上赶酸至剩余液体体积约1mL，冷却后用0.5%（v/v）硝酸溶液转移至10mL或25mL容量瓶中定容，摇匀待测，同时制备空白样品（不加供试品，其余操作与供试品一致）。含铝佐剂、氢氧化铝凝胶的疫苗样品需适当增加硝酸用量至10mL，延长200℃消解时间至30min，确保铝盐完全溶解，避免沉淀吸附锰元素导致结果偏低。含脂质、油脂的样品（如脂质体疫苗、脂肪乳类辅料）需增加过氧化氢用量至3mL，预消解时间延长至1h，确保有机质完全消解。表1微波消解升温程序参考步骤升温时间（min）目标温度（℃）保持时间（min）15120523150533180154320020精密称取/量取供试品同微波消解法，置于玻璃消解管中，加入硝酸-高氯酸（4:1，v/v）混合酸10mL，加盖小漏斗后置于通风橱内冷消解过夜。次日将消解管置于可控温电热板上，120℃加热消解至冒黄烟，逐步升温至160℃，直至消解液澄清无色或呈淡黄绿色，继续加热赶酸至近干（避免蒸干导致锰元素损失），冷却后加入0.5%硝酸溶液溶解残渣，转移定容至10mL或25mL容量瓶中，摇匀待测，同时制备空白样品。湿法消解需严格控制加热温度，避免高氯酸爆炸，含挥发性成分的样品不适用本方法。5.4.2.3直接稀释法（仅适用于基质简单、无明显蛋白/脂质干扰的样品）对于澄清、无沉淀、蛋白质含量低于1%的注射液、缓冲液类样品，可采用0.5%硝酸直接稀释5~10倍后测定，无需消解，但需进行基质效应验证，确保无明显干扰。6各测定方法操作细则6.1目视比色法（限量检查法）6.1.1方法原理在pH3.0~3.5的乙酸-乙酸钠缓冲体系中，锰离子被高碘酸钾氧化为紫红色的高锰酸根离子，颜色深浅与锰含量成正比，将供试品管与相同条件下处理的限量标准管进行目视比色，判定是否符合限度要求。6.1.2试剂配制6.1.2.1乙酸-乙酸钠缓冲液（pH3.5）：称取乙酸钠20g，加适量水溶解，用冰醋酸调节pH值至3.5，加水稀释至1000mL，摇匀备用。6.1.2.2高碘酸钾溶液：称取高碘酸钾5g，加10%（v/v）硫酸溶液溶解并稀释至100mL，摇匀备用。6.1.2.3氟化钠溶液（20g/L）：称取氟化钠2g，加水溶解并稀释至100mL，用于掩蔽铁离子干扰。6.1.2.4锰标准工作液：精密量取1μg/mL锰标准中间液，用0.5%硝酸稀释为每1mL含1μg锰的工作液，临用前配制。6.1.3操作步骤取供试品前处理溶液10mL（或直接取样的供试品溶液），置于25mL比色管中，加入氟化钠溶液1mL、乙酸-乙酸钠缓冲液2mL、高碘酸钾溶液1mL，摇匀后置于沸水浴中加热10min，取出冷却至室温，加水定容至25mL。另取相当于供试品限度值的锰标准工作液，置于另一支比色管中，同法处理作为对照管。若供试品溶液本身有颜色，需额外制备样品空白管：取相同体积供试品溶液，不加高碘酸钾，其余试剂同法处理，用于扣除底色干扰。6.1.4结果判定供试品管扣除底色后的紫红色深度浅于或等于对照管的，判定为符合限度要求；深于对照管的，判定为不符合限度要求。本方法检出限为0.05μg/mL，定量限为0.2μg/mL，适用于限度≥0.5μg/mL的样品筛查。6.2石墨炉原子吸收分光光度法（GFAAS）6.2.1方法原理样品经消解后注入石墨炉原子化器，经干燥、灰化、原子化阶段，锰化合物转化为基态原子，吸收锰空心阴极灯发射的279.5nm特征共振线，吸光度值与锰含量成正比，采用外标法定量。6.2.2仪器参数参考波长279.5nm，狭缝宽度0.2nm，灯电流5mA，背景校正采用塞曼效应校正或氘灯校正，石墨炉升温程序见表2，原子化阶段停气，其余阶段氩气流量为200mL/min。表2石墨炉升温程序参考阶段温度（℃）升温时间（s）保持时间（s）干燥1101020灰化12001010原子化230005净化250003基体改进剂：0.1%硝酸钯+0.05%硝酸镁混合溶液，称取硝酸钯0.1g、硝酸镁0.05g，用0.5%硝酸溶解并稀释至100mL，摇匀备用。6.2.4校准曲线制备6.2.4.1溶剂校准曲线：适用于基质效应≤±20%的样品，精密量取锰标准工作液，用0.5%硝酸配制成浓度为0、0.5、1、2、5、10、20μg/L的系列标准溶液，依次进样测定，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制校准曲线，要求相关系数r≥0.995。6.2.4.2基质匹配校准曲线：适用于基质效应＞±20%的样品，采用全程空白基质溶液配制上述系列浓度标准溶液，其余操作同溶剂校准曲线。6.2.4.3标准加入法：基质效应无法通过基质匹配曲线消除时使用，取4份相同体积的供试品溶液，分别加入0、0.5、1、2倍供试品预计锰含量的锰标准溶液，用0.5%硝酸定容至相同体积，测定吸光度后绘制曲线，曲线与横坐标的截距绝对值即为供试品溶液中锰的浓度。6.2.5样品测定取供试品溶液20μL，加入基体改进剂5μL，同法测定吸光度，从校准曲线中读取对应锰浓度。本方法检出限≤0.01μg/L，定量限≤0.03μg/L，加标回收率需控制在80%~115%之间，精密度RSD≤10%。6.3电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）6.3.1方法原理样品经消解后由载气带入电感耦合等离子体焰炬中，锰元素被原子化并激发，发射出257.6nm、279.5nm、294.9nm的特征谱线，谱线强度与锰含量成正比，采用外标法定量。6.3.2仪器参数参考射频功率1300W，载气流量0.7L/min，辅助气流量0.2L/min，等离子气流量15L/min，观测高度15mm，积分时间10s，同时选择2条以上特征谱线测定，扣除背景干扰。6.3.3校准曲线制备用0.5%硝酸配制浓度为0、10、50、100、500、1000μg/L的系列标准溶液，依次进样测定，以浓度为横坐标、谱线强度为纵坐标绘制校准曲线，要求相关系数r≥0.999。基质效应明显的样品需采用基质匹配校准曲线。6.3.4样品测定进样供试品溶液，测定特征谱线强度，代入校准曲线得到锰浓度。本方法检出限≤5μg/L，定量限≤15μg/L，加标回收率需控制在85%~110%之间，精密度RSD≤5%。6.4电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）6.4.1方法原理样品消解后经雾化进入等离子体，锰元素被电离为m/z=55的阳离子，经质谱系统分离后检测离子信号强度，与标准品比较定量。采用氦气碰撞反应池模式消除40Ar15N、55Fe等同质异位和多原子离子干扰，以45Sc为内标校正信号漂移。6.4.2仪器参数参考射频功率1550W，载气流量1.0L/min，氦气碰撞气流量4.5mL/min，雾化室温度2℃，采集m/z=55（锰）、m/z=45（钪，内标），内标溶液为10μg/L的钪标准溶液，采用在线加入方式。6.4.3校准曲线制备用0.5%硝酸配制浓度为0、0.01、0.1、1、5、10μg/L的系列标准溶液，依次进样测定，以内标校正后的信号强度为纵坐标、浓度为横坐标绘制校准曲线，要求相关系数r≥0.999。6.4.4样品测定进样供试品溶液，测定内标校正后的信号强度，代入校准曲线得到锰浓度。本方法检出限≤0.001μg/L，定量限≤0.003μg/L，加标回收率需控制在85%~110%之间，精密度RSD≤8%，为锰盐测定的仲裁方法。7结果计算与表述7.1定量结果计算公式锰含量（以Mn计，μg/g或μg/mL）按式（1）计算：X=(C-C0)×V×f/m（1）式中：X——供试品中锰的含量，μg/g（固体）或μg/mL（液体）；C——供试品溶液中锰的测定浓度，μg/L；C0——空白溶液中锰的测定浓度，μg/L；V——供试品溶液定容体积，mL；f——供试品溶液的稀释倍数；m——供试品的取样量，g（固体）或mL（液体）。7.2结果表述7.2.1限量检查法：结果直接表述为“符合限度要求”或“不符合限度要求”，若样品存在底色干扰，需扣除样品空白后再进行比色判定。7.2.2定量测定法：当测定值≥定量限时，结果保留2位有效数字，或根据限度值的精度保留至小数点后2位；当测定值介于检出限与定量限之间时，表述为“检出锰，含量＜XXμg/L（定量限值）”；当测定值＜检出限时，表述为“未检出锰（检出限＜XXμg/L）”。8质量控制要求8.1空白质控：每批次试验需同时制备至少2份全程空白样品，空白样品中锰的测定值不得超过对应方法的检出限，若超出则说明存在外源性污染，需排查器皿、试剂、环境的污染来源，重新处理样品。8.2校准曲线质控：校准曲线的相关系数需满足对应方法的要求，每测定10个样品需插入1次校准曲线中间浓度点进行核查，中间浓度点的测定值与理论值的偏差不得超过±10%，否则需重新制备校准曲线并重新测定该批次样品。8.3质控样核查：每批次试验需同时测定1个与样品基质匹配的有证标准物质（CRM）或已知浓度的加标质控样品，质控样品的测定值与真值的偏差不得超过±15%，否则该批次测定结果无效，需重新试验。8.4平行样质控：每个供试品需同时做2份平行测定，平行样的相对偏差不得超过15%，若超出需重新取样测定。9污染防控要求9.1试剂本底控制：每批次购置的硝酸、过氧化氢等试剂需进行本底验证，锰含量超过方法检出限的试剂不得使用。9.2器皿专用：试验所用器皿需专用，不得与其他试验混用，每次使用后需立即浸泡于20%硝酸溶液中，避免交叉污染。9.3过程防控：取样、前处理、测定过程中避免接触金属物品，移液器枪头需采用无金属残留的盒装灭菌枪头，避免引入外源性锰污染。10方法学验证要求当采用本指南未收录的方法、或检测基质特殊的样品（如细胞裂解液、病毒载体类疫苗、含特殊佐剂的制品）时，需开展完整的方法学验证，验证