生物制品镍盐测定指南（试行）

生物制品镍盐测定指南（试行）1适用范围1.1本指南规定了生物制品中镍残留的测定方法、操作规范、质量控制及结果判定规则，适用于重组蛋白类药物、单克隆抗体药物、预防性/治疗性疫苗、血液制品、细胞治疗产品、基因治疗产品的原液、中间品、成品，以及配套生产用原辅材料（细胞培养基、层析填料洗脱液、药用辅料等）、工艺用水、生产设备接触面洗脱液中镍含量的定性定量检测。

1.2本指南包含石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS，第一法）和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS，第二法）两种检测方法：GFAAS适用于镍含量预期≥0.5μg/L的样品检测，ICP-MS适用于镍含量预期≥0.01μg/L的样品检测，可根据样品限量要求、检测通量自主选择适宜方法。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

-《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0406原子吸收分光光度法

-《中华人民共和国药典》2025年版四部通则0412电感耦合等离子体质谱法

-GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

-ICHQ3D（R1）元素杂质指导原则

-GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测

3方法原理

3.1石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）

样品经湿式消解完全破坏有机基质后，将待测液注入石墨炉原子化器，经干燥、灰化、原子化阶段，样品中的镍化合物转化为镍基态原子；基态原子可吸收镍空心阴极灯发射的232.0nm特征共振谱线，在一定浓度范围内，吸光度值与镍元素浓度呈线性正相关，通过标准曲线法定量计算样品中镍含量。本方法检出限为0.1μg/L，定量限为0.3μg/L。

3.2电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）

样品经消解后制备为酸性水溶液，由载气带入雾化系统雾化后进入氩等离子体中，在6000~8000K高温下完成蒸发、解离、原子化、离子化过程，产生的镍离子经离子传输系统进入质量分析器，按照质荷比（m/z）分离，选择m/z=58、m/z=60的镍同位素进行检测，其离子计数强度与镍元素浓度呈线性正相关，通过内标校正法消除基体效应、仪器波动影响，定量计算样品中镍含量。本方法检出限为0.003μg/L，定量限为0.01μg/L。

4试剂与材料

4.1实验用水：符合GB/T6682-2008规定的一级水，电阻率≥18.2MΩ·cm（25℃），且水中镍含量需低于方法检出限。

4.2硝酸：优级纯及以上级别，优先选用质谱级硝酸；每批次硝酸需进行空白验收，取5mL硝酸经赶酸、定容至10mL后，镍含量需低于方法定量限。

4.330%过氧化氢：优级纯，每批次需进行空白验收，镍含量低于方法定量限。

4.4镍标准储备液：国家有证标准物质，浓度为1000μg/mL，有效期参照标准物质证书规定，开封后4℃密封保存可使用6个月。

4.5镍标准工作液：临用前配制，将镍标准储备液用1%（v/v）硝酸溶液逐级稀释至所需浓度，配制过程避免交叉污染，浓度≤10μg/L的低浓度工作液需现配现用。

4.6基体改进剂（GFAAS用）：10g/L钯标准溶液（有证标准物质）或5g/L硝酸镁溶液（优级纯配制），可减少样品基体干扰，提高灰化效率，其镍空白需符合要求。

4.7内标溶液（ICP-MS用）：选择钪（Sc，m/z=45）或铑（Rh，m/z=103）作为内标元素，储备液为1000μg/mL有证标准物质，临用前用1%硝酸稀释至10μg/L，可采用在线加入或离线加入方式。

4.8容器处理：所有接触样品、试剂的容器（消解罐、容量瓶、移液枪头、离心管等）均需采用聚丙烯或聚四氟乙烯材质，使用前置于20%（v/v）硝酸溶液中浸泡≥24h，取出后用实验用水冲洗至少6次，晾干后密封保存备用；禁止使用玻璃容器长期盛放酸性镍待测液，避免玻璃中镍析出干扰结果。

4.9质控样品：选用镍含量已知的生物基质有证标准物质，或实验室内部赋值的稳定质控样品，用于每批次检测的质量控制。

5仪器与设备

5.1检测仪器：石墨炉原子吸收光谱仪（配镍空心阴极灯、氘灯或塞曼背景校正装置）或电感耦合等离子体质谱仪，仪器需经法定计量部门检定合格且在有效期内。

5.2前处理设备：微波消解仪（配聚四氟乙烯消解罐，最高耐受温度≥220℃，压力≥10MPa）、控温电热板（温度调节范围室温~200℃，控温精度±5℃）、分析天平（精度0.0001g）、超纯水仪、恒温水浴振荡器、生物安全柜（处理致病性生物样品时使用）。

5.3仪器性能要求

5.3.1GFAAS：灯电流设置3~5mA，波长232.0nm，狭缝宽度0.2nm，石墨炉升温程序可按需优化，背景校正装置工作正常。

5.3.2ICP-MS：仪器经调谐液（含1μg/L锂、钴、铟、铀）调谐后，需满足：氧化物产率（CeO+/Ce+）≤2%，双电荷离子产率（Ce2+/Ce+）≤3%，灵敏度满足1μg/L铟的计数≥20000cps，质量轴偏差≤0.05amu。

6样品采集与保存

6.1采样要求：采样过程避免接触金属器具，采集的样品需具有代表性：原液、液体中间品、液体成品需摇匀后采样；冻干样品需按说明书复溶完全后采样；固体原辅材料需研磨过100目筛后混匀采样；工艺用水、接触面洗脱液直接采集即可；含活病毒、致病性细胞的样品需先经100℃水浴30min或其他验证合格的灭活方式处理后再采样。

6.2样品标识：每个样品粘贴唯一性标识，标注样品名称、批号、采样日期、采样人、样品状态等信息。

6.3样品保存：采集后的样品置于无金属污染的聚丙烯离心管中，密封后4℃冷藏保存不超过7d，-20℃冷冻保存不超过30d，避免反复冻融，检测前需恢复至室温并摇匀。

7分析步骤

7.1第一法石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）

7.1.1样品前处理

优先选用微波消解法，对于易消解、低有机物含量的样品可采用直接稀释法。

（1）微波消解法：称取混匀样品0.20.5g（精确至0.0001g，液体样品可量取0.52.0mL）置于消解罐中，加入5mL硝酸、2mL30%过氧化氢，加盖密封后放入微波消解仪，参考升温程序为：120℃升温5min，保持5min；150℃升温3min，保持5min；180℃升温5min，保持20min。消解完成后冷却至罐内温度≤60℃，取出消解罐开盖，置于控温电热板上140℃赶酸至消解液剩余0.5~1.0mL，冷却至室温后将消解液转移至10mL容量瓶，用1%硝酸洗涤消解罐内壁3次，洗涤液合并至容量瓶，定容至刻度，摇匀待测。

含高浓度螯合剂（如EDTA、枸橼酸盐）的样品，可适当延长180℃消解时间至30min，保证镍与螯合剂的结合键完全断裂；高盐、高油脂样品消解后若有不溶物，可经0.22μm聚丙烯滤膜过滤后待测。

（2）直接稀释法：适用于工艺用水、浓度≤10g/L的低浓度蛋白溶液等基质简单的样品，取1mL样品加入9mL1%硝酸，摇匀后直接待测，该方法需经过回收率验证合格后方可使用。

7.1.2空白试验

不加样品，其余操作与样品前处理完全一致，制备试剂空白溶液，每批次样品需至少制备2份试剂空白。

7.1.3标准曲线制备

将镍标准工作液用1%硝酸稀释为浓度分别为0μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L、50μg/L的系列标准溶液，分别取20μL标准溶液与5μL基体改进剂混合后注入石墨炉，按照设定的石墨炉程序测定吸光度，以镍浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，要求线性相关系数r≥0.995。

石墨炉参考升温程序：干燥阶段100℃，ramp5s，保持20s；灰化阶段1400℃，ramp10s，保持15s；原子化阶段2400℃，ramp0s，保持5s（停气）；净化阶段2600℃，ramp1s，保持3s。

7.1.4样品测定

取20μL待测样品溶液与5μL基体改进剂混合后注入石墨炉，同标准曲线测定条件测定吸光度，每个样品平行测定3次，相对标准偏差（RSD）≤5%，代入标准曲线计算待测液中镍浓度。若样品浓度超出标准曲线线性范围，需用1%硝酸稀释后重新测定。

7.2第二法电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）

7.2.1样品前处理

同7.1.1微波消解法，定容时可选择离线加入内标，即定容前加入内标储备液，使得定容后内标浓度为10μg/L；也可选择在线加入内标，即仪器采用双蠕动泵管，分别吸入待测液与内标工作液，在线混合后进入仪器。

7.2.2空白试验

同7.1.2。

7.2.3标准曲线制备

将镍标准工作液用1%硝酸稀释为浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L的系列标准溶液，加入与样品一致的内标，按照仪器操作规范测定m/z=58Ni、m/z=60Ni的离子计数以及内标元素的离子计数，以镍浓度为横坐标，镍离子计数与内标离子计数的比值为纵坐标绘制标准曲线，要求线性相关系数r≥0.999。

若样品中铁含量较高（>100mg/L），存在58Fe对58Ni的同量异位素干扰，可采用干扰校正方程：C(Ni58)=C(58)-0.0031*C(56Fe)，或选择m/z=60Ni作为定量同位素。

7.2.4样品测定

同标准曲线测定条件测定待测样品，每个样品平行测定3次，RSD≤3%，代入标准曲线计算待测液中镍浓度，超出线性范围的样品需稀释后重新测定。高浓度样品测定后需用1%硝酸冲洗系统≥2min，避免记忆效应干扰后续样品检测。

8结果计算与表述

8.1结果计算公式

样品中镍含量按照下式计算：

式中：

-X——样品中镍的含量，单位为μg/kg（固体样品）或μg/L（液体样品）；

-C——待测液中镍的浓度，单位为μg/L；

-C0——试剂空白中镍的浓度，单位为μg/L；

-V——样品定容体积，单位为mL；

-f——样品测定前的稀释倍数；

-m——样品取样量，单位为g（固体样品）或mL（液体样品）。

8.2结果表述

8.2.1当样品镍含量≥定量限时，结果保留两位有效数字，或与产品限量要求的精度一致；

8.2.2当样品镍含量在检出限与定量限之间时，表述为“<定量限”，并标注定量限数值；

8.2.3当样品镍含量低于检出限时，表述为“未检出（<检出限）”，并标注检出限数值。

8.3检出限与定量限计算

方法检出限（LOD）为3倍试剂空白测定值的标准偏差除以标准曲线斜率；方法定量限（LOQ）为10倍试剂空白测定值的标准偏差除以标准曲线斜率，每次方法验证或换批次试剂时需重新计算LOD、LOQ。

9方法学验证要求

本方法用于特定基质样品检测前，需完成方法学验证，验证指标及要求如下：

9.1专属性：取空白基质（不含镍的同类型生物样品）、空白基质加镍标准溶液、待测样品分别测定，空白基质无明显镍响应（响应值低于LOD），加标样品回收率符合要求，证明无基质干扰。若基质干扰明显，需采用标准加入法进行定量，或优化前处理方法消除干扰。

9.2准确度：采用加标回收法验证，选取低、中、高三个加标浓度（分别为LOQ、限量值的50%、限量值的150%），每个浓度平行制备6份样品，平均加标回收率需在80%120%范围内，RSD≤10%；对于镍含量<1μg/L的低浓度样品，回收率可放宽至70%130%，RSD≤15%。

9.3精密度：①重复性：同一操作人员同一批次测定同一样品6次，测定结果的RSD≤10%，低浓度样品RSD≤15%；②中间精密度：不同操作人员、不同日期、不同仪器测定同一样品，测定结果的RSD≤15%，低浓度样品RSD≤20%。

9.4线性与范围：标准曲线相关系数符合7.1.3、7.2.3要求，线性范围需覆盖样品可能的镍含量范围，下限≤LOQ，上限≥限量值的2倍。

9.5稳定性：待测液室温放置24h后测定，镍含量与初始测定值的相对偏差≤10%，证明待测液在24h内稳定。

9.6耐用性：考察前处理消解时间、赶酸温度、仪器参数微小变动对测定结果的影响，结果RSD≤15%，证明方法耐用性符合要求。

10质量控制要求

10.1每批次检测需同时测定试剂空白，试剂空白的镍含量需低于LOQ，否则需排查试剂、容器污染原因，重新制备样品。

10.2每批次检测需同时测定质控样品，质控样品的测定值需在标称值的±10%范围内，低浓度质控样品可放宽至±15%，否则本次检测结果无效。

10.3每10个样品需测定一个平行样，平行样测定结果的相对偏差≤15%，否则需重新测定该样品。

10.4每批次检测需带一个加标回收样品，加标回收率需符合9.2要求，否则本次检测结果无效。

11结果判定

11.1按照对应产品的注册标准、《中国药典》相关要求或ICHQ3D规定的镍允许日暴露量（PDE=200μg/天）换算限值进行判定，若样品镍含量≤限值要求，判定为符合规定；

11.2若样品镍含量超出限值要求，需重新取样复检，复检结果仍超出限值的，判定为不符合规定；

11.3若样品镍含量低于LOQ，且限值要求高于LOQ时，判定为符合规定。

12注意事项

12.1污染防控：镍是环境中普遍存在的元素，检测全过程需严格控制污染：实验人员需佩戴无粉乳胶手套，避免皮肤接触样品；实验服避免配备金属拉链、纽扣，操作时避免接触金属器具；实验室环境需定期清洁，避免灰尘带入污染；消解罐每次使用后需置