生物制品热原检查指南（试行）

生物制品热原检查指南（试行）本指南适用于细菌类疫苗、病毒类疫苗、联合疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、重组细胞因子、单克隆抗体、双特异性抗体、抗体药物偶联物、基因工程蛋白类制剂、体内诊断试剂、细胞治疗产品、基因治疗产品等各类生物制品的原液、半成品、成品，以及生产过程中需控制热原的工艺辅料、工艺中间体、直接接触制品的包装材料、生产系统清洁验证样品的热原检测及质量控制。凡生物制品质量标准中规定需控制热原的样品，均需按本指南要求开展检测。一、规范性引用文件本指南引用文件包括《中华人民共和国药典》2025年版三部通则1142热原检查法、通则1143细菌内毒素检查法、通则9015药品质量标准分析方法验证指导原则；ICHQ2（R1）分析方法验证指南、ICHQ7（R2）原料药生产质量管理规范、ICHQ12药品上市后变更管理指南；WHO生物制品质量控制手册（2023版）、中国《药品生产质量管理规范（2010年修订）》附录生物制品相关要求。所有引用文件如有更新，按最新版本执行。二、基本要求（一）人员要求所有从事热原检测的人员需经过法规、检测方法、操作规范、动物伦理（涉及家兔法）专项培训，经理论和实操考核合格后方可上岗。操作细菌内毒素检查的人员需掌握内毒素污染防控要点、干扰因素识别及消除方法；操作家兔法的人员需熟练掌握家兔体温测量、静脉注射操作技能，能准确识别家兔异常生理状态。对动物毛发、鲎试剂成分过敏的人员不得参与对应检测项目操作。（二）环境要求细菌内毒素检查操作区需设置独立的无热原洁净操作间，环境洁净度不低于D级，操作台面采用无吸附、易消毒的不锈钢材质，避免内毒素残留。家兔热原检查实验室需分区设置饲养区、准备区、试验操作区，饲养区温度控制在18~28℃，相对湿度40%~70%，昼夜明暗周期各12小时，噪音≤60dB，试验操作区需保持恒温，温度波动≤±2℃，避免人员频繁出入、强光、噪音刺激导致家兔体温异常。（三）器具要求所有接触供试品、内毒素标准品、鲎试剂、重组C因子试剂的器具需彻底除热原：玻璃器具（试管、移液管、容量瓶等）需经铬酸洗液浸泡去除有机物后，用注射用水冲洗干净，250℃干烤≥30分钟或180℃干烤≥2小时；一次性耗材（移液枪头、离心管、微孔板等）需选用经认证无内毒素的产品，开封后需密闭保存，避免环境污染。禁止使用含表面活性剂的洗涤剂清洗相关器具，避免残留干扰检测结果。（四）试剂要求细菌内毒素检查用水内毒素含量需≤0.015EU/ml，且无鲎试剂反应抑制/增强作用；鲎试剂需符合药典规定，每批采购后需开展灵敏度复核，复核结果与标示灵敏度偏差不超过±1个稀释度方可使用；细菌内毒素工作标准品需溯源至中国食品药品检定研究院或WHO国际标准品，赋值误差≤±10%；家兔法所用稀释液（0.9%氯化钠注射液等）需提前经热原检查合格，给药前预热至37±1℃。三、检测方法选择原则热原检测方法选择需遵循“科学合理、合规适用、灵敏准确”的原则，优先选择体外检测方法，减少动物使用：1.对于组分明确、无鲎试剂反应干扰因素的生物制品（如重组蛋白类制剂、血液制品、灭活疫苗等），首选细菌内毒素检查法，纳入质量标准的需完成完整方法学验证。2.对于存在不可消除的鲎试剂反应干扰、含有葡聚糖/蛋白酶/鳌合剂等干扰成分、或药典要求采用家兔法的品种（如抗毒素、活疫苗、含细胞基质残留的制品等），采用家兔热原检查法。3.重组C因子法、单核细胞激活试验法可作为补充方法用于生产过程中间品、工艺辅料、清洁验证样品的热原筛查，不得直接用于成品放行检测，除非完成方法学比对并经监管部门认可。4.同一品种的热原检测方法不得随意变更，确需变更的需按药品变更指导原则要求开展验证，报监管部门批准后方可实施。四、细菌内毒素检查法操作规范（一）方法学验证1.内毒素限值（L）确定：按公式`L=K/M`计算，其中K为不同给药途径的内毒素暴露阈值：静脉给药（含滴注）`K=5EU/(kg·h)`，鞘内给药`K=0.2EU/(kg·h)`，肌肉/皮下/黏膜给药`K=10EU/(kg·h)`；M为人体每公斤体重每小时最大给药剂量，按说明书规定的最大推荐剂量、最短输注/给药时间计算，对于需多次给药的品种需按每日累积最大暴露量计算限值。举例：某抗PD-1单抗静脉给药最大剂量为20mg/kg，输注时间为0.5小时，则`M=40mg/(kg·h)`，`L=5/40=0.125EU/mg`。2.干扰试验：凝胶法干扰试验：将供试品按2倍梯度稀释为至少4个浓度，每个浓度设置4组平行管：①供试品管：0.1ml供试品溶液+0.1ml鲎试剂；②供试品阳性管：0.1ml含2λ内毒素的供试品溶液+0.1ml鲎试剂；③阴性对照：0.1ml内毒素检查用水+0.1ml鲎试剂；④阳性对照：0.1ml含2λ内毒素的检查用水+0.1ml鲎试剂。37±1℃孵育60±2分钟后倒转180°判定结果，要求阴性对照全部阴性、阳性对照全部阳性、所有浓度供试品阳性管全部阳性，若某稀释度满足上述条件，即为无干扰的最低稀释倍数。若供试品阳性管出现阴性，提示存在抑制干扰，需继续稀释或采用干扰消除措施；若供试品管阳性、加标0.5λ内毒素回收率>200%，提示存在增强干扰，需提高稀释倍数。定量法（动态浊度法、动态显色法、终点显色法）干扰试验：制备系列浓度内毒素标准曲线（至少5个浓度点），要求相关系数`r≥0.98`；制备供试品溶液及加标供试品溶液（加标浓度为限值的50%~150%），平行测定6次，计算加标回收率，回收率在50%~200%范围内判定为无干扰。3.干扰消除验证：常用干扰消除方法包括稀释法、pH调节法（将供试品pH调节至6.0~8.0，为鲎试剂反应最适范围）、加入适量Mg²+补充二价阳离子、采用无热原透析膜透析去除小分子干扰物、加入特异性蛋白酶抑制剂消除蛋白水解作用。所有消除方法需经过验证，确认不会导致内毒素吸附、降解，加标回收率符合要求后方可采用。4.方法性能验证：定量法需额外验证线性、精密度、准确度、专属性：线性范围需覆盖限值的20%~200%；日内精密度变异系数`CV≤10%`，日间精密度`CV≤15%`；准确度回收率在50%~200%范围内；专属性要求加入与供试品共存的工艺杂质（如宿主细胞蛋白、残留DNA、辅料）不干扰检测结果。（二）常规检测操作1.样品处理：供试品按规定储存条件取出后恢复至室温（20~25℃），冻干品按说明书要求加入无内毒素检查用水复溶，轻轻振摇使完全溶解，避免剧烈振摇产生泡沫导致内毒素吸附。供试品需充分混匀，混悬液、乳剂需采用涡旋混匀≥30秒，确保内毒素分布均匀。2.加样操作：按验证确定的稀释倍数稀释供试品，移液枪需经校准，每更换一次样品需更换无内毒素枪头，避免交叉污染。按要求设置阴性对照、阳性对照、供试品阳性对照、供试品管，每个样品平行做2管。3.孵育与检测：凝胶法样品置于37±1℃恒温水浴或恒温箱中孵育60±2分钟，孵育过程中禁止震动、移动试管，避免凝胶破碎导致假阴性。定量法按仪器及试剂说明书设置孵育温度、时间、检测参数，实时记录反应数据。（三）结果判定1.试验有效性判定：阴性对照全部阴性、阳性对照全部阳性、供试品阳性对照全部阳性，判定试验有效，否则试验无效，需排查原因后重测。2.合格判定：凝胶法供试品管全部阴性，判定为符合规定；若1管阳性，需取双倍数量供试品复试，复试全部阴性判定为符合规定，否则不符合。定量法供试品内毒素含量低于限值的判定为符合规定，高于或等于限值的判定为不符合；若结果在限值±10%范围内，需复测2次，取平均值判定。五、家兔热原检查法操作规范（一）方法学预试验首次采用家兔法检测的品种需开展预试验，确认给药剂量下家兔无急性毒性、过敏反应、异常体温降低，不会导致家兔死亡，方可开展正式检测。给药剂量按人体最大给药剂量的3~10倍换算，家兔静脉给药体积不超过10ml/kg，注射时间不少于1分钟。（二）家兔筛选要求试验用家兔需为健康成年兔，体重1.7~3.0kg，雌兔无孕，体温范围38.0~39.6℃，同一批试验家兔的基础体温差≤1℃。家兔需提前7天进入实验室适应环境，试验前16~18小时禁食，不禁水。试验前30分钟将家兔固定于兔盒中，每30分钟测量一次肛温，连续2次体温差≤0.2℃的家兔方可用于试验，2次体温平均值为该兔的正常体温。用过的家兔需休息≥7天方可再次使用，若单次试验升温≥0.6℃需休息≥14天，累计使用次数不超过10次。（三）试验操作将预热至37±1℃的供试品经耳缘静脉缓慢注入家兔体内，注射时间≥1分钟。给药后每30分钟测量一次肛温，连续测量3小时，共6次，每次体温与正常体温的最大差值为该兔的最大升温值。体温测量时肛温计插入直肠深度为2~3cm，每次测量时间不少于1分钟，测量后用75%酒精消毒肛温计，避免交叉感染。（四）结果判定1.初试：采用3只家兔，若3只家兔最大升温值均<0.6℃，且总和<1.4℃，判定为符合规定；若1只及以上家兔升温≥0.6℃，或总和≥1.4℃，需启动复试。2.复试：采用5只未使用过的健康家兔，结合初试3只共8只家兔的结果，若升温≥0.6℃的家兔数量≤1只，且8只总升温值<3.5℃，判定为符合规定，否则判定为不符合。3.异常情况处理：若家兔给药后出现体温降低>0.4℃、过敏、抽搐、死亡，该兔数据无效，需排查原因（供试品毒性、操作刺激、家兔本身患病等），更换家兔重测。（五）伦理要求家兔饲养、试验、处置需符合《实验动物福利伦理审查指南》要求，试验过程中尽量减少家兔应激，试验结束后采用人道方式处死，不得随意丢弃。六、补充检测方法（重组C因子法）操作规范重组C因子法仅对革兰氏阴性菌内毒素有特异性响应，适用于工艺中间品、辅料、清洁验证样品的快速筛查：1.方法学验证：需与药典规定的细菌内毒素检查法开展比对，至少20批样品检测结果一致性≥95%，加标回收率在80%~120%范围内，线性相关系数`r≥0.99`，精密度`CV≤5%`，方可使用。2.操作要求：按试剂盒说明书开展样品处理、加样、孵育、检测，严格防控内毒素污染，设置阴性对照、阳性对照、空白对照，所有对照符合要求后方可判定结果。3.结果应用：检测结果低于限值的可判定为合格，高于限值的需采用药典方法复核，不得直接作为成品放行依据。七、质量控制与偏差处理（一）日常质量控制1.试剂质控：每批鲎试剂、内毒素标准品、重组C因子试剂需开展批间一致性核验，内毒素检查用水每批检测内毒素含量，符合要求方可使用。2.仪器质控：体温计每年校准至少1次，误差≤0.1℃；干烤箱每季度采用1000EU内毒素指示剂开展除热原效果验证，确认处理后内毒素残留≤0.03EU；移液枪每半年校准1次，误差≤0.5%；内毒素检测仪每季度校准吸光度、温度模块，误差符合要求方可使用。3.样品质控：供试品取样采用无内毒素取样器具，取样后24小时内检测，如需保存需置于-20℃冷冻，冻融次数不超过2次，避免内毒素降解或吸附。所有样品需标识清晰，可追溯至生产批次、取样点、取样时间。（二）偏差处理1.试验无效偏差：出现阴性对照阳性、阳性对照阴性、供试品阳性对照不符合要求的，判定为试验无效，需排查原因：试剂污染、器具除热原不彻底、操作交叉污染、孵育温度/时间不符合要求、试剂过期等，原因排查并整改后重新开展试验。2.样品不合格偏差：若供试品复测后仍超出热原限值，需启动偏差调查：①检测过程调查：复核检测记录、试剂、仪器是否符合要求；②生产过程调查：检测工艺用水、辅料、工艺中间体、包装材料的热原含量，排查除热原工艺（超滤、纳米过滤、干热/湿热灭菌）是否符合要求，是否存在生产系统清洁不到位、储存运输过程破损污染等问题；③制定纠正预防措施，优化工艺参数，开展变更验证，避免同类问题重复发生。八、记录与报告要求所有热原检测记录需真实、完整、可追溯，内容包括：样品信息（名称、批号、规格、生产厂家、取样时间）、试剂信息（批号、灵敏度、有效期）、仪器信息（编号、校准状态）、操作过程（稀释倍数、孵育时间、温度）、检测数据、结果判定、操作人员及审核人员签字。记录保存期限符合GMP要求，至少至产品有效期后1年，无有效期的产品保存至少5年。方法验证报告需包含限值计算依据、干扰试验数据、方法性能验证数据、结论，经质量负责人审核后归档。九、注意事项1.内毒素检测操作需佩戴无粉无内毒素手套，禁止用手接触器具内壁、管口，避免皮肤表面的内毒素污染样品。2.配制好的内毒素标准溶液需