生物制品无菌检查指南（试行）

生物制品无菌检查指南（试行）本指南适用于中国境内上市的疫苗、抗毒素/抗血清、血液制品、重组蛋白制品、细胞治疗产品、基因治疗产品、医用生物活性材料等各类生物制品的放行无菌检查、上市后监督抽检无菌检查，以及生产过程中间品的无菌过程控制检查，不适用于含活菌/活病毒成分的减毒活疫苗、活菌制剂类制品（该类制品的目标菌计数及杂菌检查参照对应品种专属药典标准及注册标准执行）。1规范性引用文件所有无菌检查操作必须符合以下文件要求，文件更新版本生效后按新版本执行：1.1《中华人民共和国药典》2025年版三部通则1101无菌检查法、通则9203药品微生物实验室质量管理指导原则；1.2《药品生产质量管理规范（2010年修订）》附录生物制品、附录无菌药品；1.3《药品检验检测机构资质认定条件与检验活动要求》；1.4《生物安全实验室建设与管理规范》（GB50346-2011）；1.5国家药品监督管理局发布的生物制品相关技术指导原则。2检查前准备2.1人员要求2.1.1所有参与无菌检查的人员必须经过GMP微生物检验实操培训、无菌操作技术专项培训、生物安全防护培训，考核合格后持证上岗，每年至少开展1次再培训及实操考核，考核内容包括无菌操作规范、污染防控、偏差处理、生物安全应急处置，考核合格率需达到100%。2.1.2直接接触高生物安全等级样本（如HIV诊断试剂、免疫细胞治疗产品、高致病性病原相关制品）的人员需额外符合BSL-2/BSL-3级实验室人员准入要求，按规定完成相关疫苗接种，定期开展健康监测。2.1.3人员手部微生物监测每季度至少开展1次，采用接触碟法（φ55mmTSA培养基）按压手部表面10s，30-35℃培养48h，菌落数需≤10cfu/碟；进入无菌检查洁净区/隔离器的人员不得佩戴首饰、不得化妆，指甲长度不得超过指尖2mm，穿戴的无菌防护服不得脱落纤维。2.2环境与设备要求2.2.1无菌检查必须在B级背景下的A级洁净区，或者符合ISO14644-15级要求的硬舱体/软舱体隔离器内开展，禁止在不符合洁净等级要求的环境中开展无菌检查。2.2.2洁净区/隔离器环境监测需与每批次检查同步开展，监测指标及合格标准如下：静态条件下≥0.5μm尘埃粒子数≤3520个/m³、≥5μm尘埃粒子数≤20个/m³；动态条件下≥0.5μm尘埃粒子数≤3520个/m³、≥5μm尘埃粒子数≤29个/m³；浮游菌≤1cfu/m³；沉降菌≤1cfu/皿（φ90mmTSA培养基，暴露30min）；接触面微生物≤1cfu/碟（接触碟法）；操作人员手套表面微生物≤1cfu/碟。环境监测数据不符合要求的，本次检查结果直接无效。2.2.3所有检验设备需在计量校准有效期内：高压灭菌器每年至少由法定计量部门校准1次，每次灭菌需同步放置嗜热脂肪芽孢杆菌ATCC7953生物指示剂（D值1.5-3.0min）验证灭菌效果，灭菌周期F0值≥12；微生物培养箱温度偏差需≤±0.5℃，每天至少自动记录2次温度，温湿度记录仪相对湿度偏差≤±5%RH；集菌仪转速偏差≤±5rpm；滤膜完整性测试仪气泡点测定偏差≤±0.05MPa。设备使用前需确认运行状态正常，填写设备使用记录。2.3培养基与试剂要求2.3.1无菌检查需使用中国药典收录的硫乙醇酸盐流体培养基（FTM，用于厌氧菌、需氧菌检测）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB，用于真菌、需氧菌检测），也可使用经国家药品监管部门认可的商品化预制培养基，不得自行修改培养基配方。2.3.2每批次培养基需开展质量验证：①无菌性检查：抽取不少于10%的制备/预制培养基，分别置于FTM对应30-35℃、TSB对应20-25℃条件下培养14天，不得有菌生长；②灵敏度检查：FTM分别接种≤100cfu的金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC9027、生孢梭菌ATCC19404，TSB分别接种≤100cfu的白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉ATCC16404，接种后72h内需出现明显可见的菌生长，与对照培养基相比生长率≥90%。灵敏度检查不合格的培养基不得使用。2.3.3培养基储存需符合要求：脱水干粉培养基按说明书条件储存，有效期不得超过3年；配制好的培养基置于2-25℃避光密封储存，储存周期不得超过14天；使用前置于30-35℃水浴复温，复温时间不得超过2h，不得反复冻融培养基。2.3.4稀释液、冲洗液采用0.1%蛋白胨水溶液或pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，经121℃高压灭菌15min，无菌性检查合格后方可使用。针对含抑菌成分的制品，可在冲洗液中添加经验证合格的中和剂：含防腐剂的制品可添加0.5%-1%聚山梨酯80；含β-内酰胺类抗生素的制品可添加每100ml冲洗液不少于100万单位的青霉素酶；含汞类防腐剂的制品可添加0.05%-0.1%巯基乙酸钠。中和剂需提前验证无抑菌、杀菌活性，对试验菌株生长无影响。2.4供试品准备2.4.1抽样要求：放行检查抽样量至少为全批次产品的0.1%，且不少于20个最小包装；批量小于100支的制品抽样量不少于10支；批量小于10支的全数抽样；上市后监督抽检抽样量不少于20个最小包装，同时抽取同批次经确认无菌的阴性对照样品10支、添加了≤100cfu试验菌株的阳性对照样品5支。抽样过程需符合无菌操作要求，避免抽样过程污染。2.4.2供试品存储、运输条件需严格符合产品说明书要求，收到供试品后需在24h内开展检查，不能立即检查的需按产品规定条件储存，普通生物制品储存时间不得超过72h，细胞治疗产品等对温度敏感的制品需在4℃条件下储存，储存时间不得超过24h，不得冷冻保存液态生物制品。3方法适用性验证生物制品普遍存在蛋白非特异性吸附、抑菌活性等干扰因素，每一个新品种、生产工艺变更、检验条件变更时，必须先开展无菌检查方法适用性验证，消除抑菌干扰后方可开展正式检验。3.1验证菌株：采用金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC9027、生孢梭菌ATCC19404、白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉ATCC16404标准菌株，菌株传代次数不得超过5代，菌液浓度调整为每1ml含菌10-100cfu，采用平皿计数法校准菌液浓度，计数偏差≤±10%。3.2验证方法优先选择薄膜过滤法，仅针对无法采用薄膜过滤法的高粘度制品、预装注射剂、细胞治疗产品可选择直接接种法。3.2.1薄膜过滤法验证：取1个最小包装量的供试品，加入≤100cfu试验菌液混合均匀后，通过孔径0.22μm/0.45μm的滤膜过滤，用不少于100ml/膜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数不少于3次，最后一次冲洗液中同步加入试验菌，过滤后分别向滤器中加入100mlFTM、100mlTSB培养基，FTM置于30-35℃培养，TSB置于20-25℃培养，同步设置阳性对照（不加供试品，同法操作）、阴性对照（不加试验菌，同法操作）。若阴性对照无菌生长，试验组菌生长情况与阳性对照无明显差异（生长时间差≤24h，生长浊度无明显差异），判为方法适用。若试验组菌生长延迟或不生长，需通过增加冲洗量、调整中和剂种类/浓度、更换滤膜材质（亲水性聚偏氟乙烯膜用于水溶性制品，疏水性聚四氟乙烯膜用于油性制品）等方式优化方法，直至符合要求。3.2.2直接接种法验证：取供试品按每10ml培养基接种不超过1ml供试品的比例，分别接种到FTM、TSB培养基中，加入≤100cfu试验菌，同法培养，判定标准同薄膜过滤法验证要求。3.3方法适用性验证报告需长期留存，每2年或产品生产工艺、检验条件发生变更时需重新开展验证。4检验操作流程4.1无菌操作要求所有操作必须在A级层流下开展，操作人员手部不得越过供试品开口上方，所有接触供试品的器具需经121℃高压灭菌30min，灭菌后有效期不得超过7天，开包后未使用的器具24h后不得再次使用。操作过程中避免产生气溶胶，高生物风险制品操作需在二级生物安全柜内开展，操作结束后用1000mg/L含氯消毒剂或75%乙醇擦拭台面，消毒效果需提前验证合格。4.2薄膜过滤法操作步骤4.2.1集菌器安装：打开无菌集菌器包装，将集菌器针头用75%乙醇擦拭消毒3次，待干后穿刺供试品瓶塞，每穿刺1个供试品更换1次针头，避免交叉污染。4.2.2过滤：开启集菌仪，转速调整为100-200rpm，将供试品全部过滤，注射用无菌粉末先用适量稀释液溶解后过滤，高粘度制品用稀释液稀释2-5倍后过滤，避免滤膜堵塞。4.2.3冲洗：按方法验证确定的冲洗量冲洗滤膜，每次冲洗量100-150ml，冲洗过程中轻轻晃动集菌器，使滤膜表面残留的供试品充分洗脱，冲洗总量一般不超过1000ml/膜，避免过度冲洗降低微生物检出率。4.2.4加培养基：冲洗完成后排尽冲洗液，分别向2筒滤器中加入100mlFTM培养基、1筒滤器中加入100mlTSB培养基（双膜集菌器分别加入FTM、TSB培养基各1筒），密封集菌器后做好标识，内容包括样品编号、批号、培养基类型、接种日期、操作人员。4.3直接接种法操作步骤4.3.1供试品处理：液体供试品直接用无菌注射器抽取规定量，固体供试品用稀释液溶解后抽取，细胞治疗产品可先经1000rpm离心5min去除大量细胞后取上清液接种，避免细胞沉淀干扰观察结果。4.3.2接种：每支15ml装FTM培养基接种供试品1ml，每支15ml装TSB培养基接种供试品1ml，每个样品接种FTM不少于10支、TSB不少于10支，同步接种对照管。4.4对照设置每批次检验必须设置三类对照，对照不符合要求的，本次检验结果直接无效：4.4.1阴性对照：取与检验用同批次的稀释液/冲洗液，同法操作接种FTM、TSB培养基，培养全程不得有菌生长。4.4.2阳性对照：取同品种同基质的无菌样品，加入≤100cfu的金黄色葡萄球菌（接种FTM）、白色念珠菌（接种TSB），同法操作，接种后72h内需出现明显菌生长。4.4.3环境对照：操作过程中在操作台面放置2个φ90mmTSA沉降碟，全程暴露，操作结束后置于30-35℃培养72h，不得有菌生长。5培养与观察5.1培养条件：FTM培养基置于30-35℃恒温培养箱培养，用于检测需氧菌、厌氧菌；TSB培养基置于20-25℃恒温培养箱培养，用于检测真菌、需氧菌。培养过程中避免晃动培养箱，避免光照直射培养基。5.2培养周期：总培养时间不得少于14天，细胞治疗产品、基因治疗产品等急需放行的制品，培养前3天每天观察1次，之后每2天观察1次；普通生物制品每3天观察1次，观察时轻轻晃动培养基，避免产生气泡，不得打开培养基管/集菌器密封口，避免污染。5.3观察内容：观察培养基是否出现浑浊、沉淀、絮状物、菌落生长、颜色变化，FTM培养基需分别观察上层需氧区、中层、下层厌氧区的生长情况。对于含颜色的供试品，可采用浊度仪、实时荧光PCR法辅助判断可疑生长，但最终结果需以分离培养结果为准。5.4可疑生长处置：若观察到可疑生长，立即将可疑管转接至TSA培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA），TSA置于30-35℃培养48-72h，SDA置于20-25℃培养5-7天，观察菌落形态，采用革兰氏染色、生化鉴定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）等方法鉴定菌株种类。5.5污染溯源：若确认检出污染菌，立即启动溯源程序，首先核查环境监测数据、人员操作记录、培养基无菌性检查结果、对照管生长情况，排除实验室污染的可能；若排除实验室污染，需立即通知生产企业核查生产环节的环境监测数据、灭菌记录、工艺操作记录，确定污染来源，溯源记录需留存不少于产品有效期后1年。6结果判定与报告6.1合格判定：所有供试品管培养14天后均无菌生长，所有对照管符合要求，判为无菌检查合格。6.2不合格判定：出现以下情况之一的，判为无菌检查不合格：①2支及以上供试品管出现明确菌生长，经鉴定为污染菌且排除实验室污染的；②1支供试品管出现菌生长，经溯源无法排除生产环节污染，或确认是生产环节污染的。若1支供试品管出现菌生长，经溯源明确为实验室操作污染（如污染菌与环境监测到的菌株一致、操作过程有明确失误），可加倍抽样重新检查，重新检查所有供试品管均无菌生长、对照符合要求的，判为合格，否则判为不合格。6.3结果报告要求：报告内容需包括供试品名称、规格、批号、生产单位、抽样日期、检验日期、检验依据、检查方法、培养基批号、灵敏度检查结果、对照结果、培养条件、培养时间、观察结果、判定结论，检验人员、复核人员、批准人员签字，加盖检验机构公章，报告不得涂改，需长期留存不少于5年，或产品有效期后2年，取较长者。7特殊品种检查要求7.1细胞治疗产品：优先采用封闭式薄膜过滤法，供试品用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释10倍后过滤，避免细胞堵塞滤膜，也可采用经验证合格的自动化微生物检测系统（如BACT/ALERT系统）开展快速检测，检出限≤10cfu/样本的可用于紧急放行，但需同步开展药典法无菌检查，最终结果以药典法为准。7.2血液制品：因蛋白含量高易产生非特异性吸附，冲洗量不低于500ml/膜，冲洗液中添加0.5%聚山梨酯80，消除蛋白吸附对微生物检出的干扰。7.3基因治疗产品：采用0.22μm亲水性聚偏氟乙烯膜过滤，冲洗次数不少于3次，避免病毒颗粒残留抑制微生物生长。7.4高粘度生物制品：如透明质酸钠凝胶、医用胶原蛋白海绵等，采用45℃预热的稀释液稀释后过滤，或直接采用直接接种法，加大培养基接种量，降低供试品浓度。8生物安全与废弃物处理8.1生物