生物制品细菌内毒素限值确定指南（试行）

生物制品细菌内毒素限值确定指南（试行）1适用范围本指南适用于中国境内研发、生产、上市的各类生物制品的细菌内毒素限值确定工作，涵盖预防类生物制品（疫苗、类毒素等）、治疗类生物制品（单克隆抗体、重组蛋白、血液制品、细胞治疗产品、基因治疗产品、溶瘤产品等）、诊断类体内用生物制品（体内造影剂、体内诊断单抗等）的全生命周期质量控制，包括临床前研究、临床试验各阶段及上市后变更场景的限值评估。以下两类情形可申请特殊评估：一是活性成分为革兰氏阴性菌或其固有含内毒素组分的生物制品，二是局部给药且内毒素无全身暴露风险的生物制品。2基本原则2.1安全性优先原则细菌内毒素限值确定需以保障临床用药安全为核心前提，基于人体对内毒素的耐受阈值设定，充分考虑产品特性、适用人群、给药方案的风险等级预留安全余量。现有全球公认的研究数据确认：健康成人静脉途径内毒素单次暴露的无毒副反应阈值为5EU/(kg·h)，鞘内（含椎管内、脑室内）给药的无毒副反应阈值为0.2EU/(kg·h)，该阈值为各国药典及监管机构的通用基准值，无充分临床安全性证据不得随意放宽。2.2基于临床最大暴露原则限值需以产品临床拟用的最大暴露场景为计算基准，即选取给药剂量最高、频次最密、给药时长最短、暴露人群敏感性最高的临床方案作为计算依据，不得采用亚临床剂量或低风险人群方案计算，确保所有临床适用场景下的内毒素暴露均低于安全阈值。2.3分阶段适配原则结合生物制品研发规律，不同研发阶段的限值要求可逐步收紧，临床试验阶段的限值不得低于上市后标准的严格程度，避免后期开发过程中出现质量标准放宽的风险：临床前研究阶段限值需满足毒理试验系统无内毒素干扰要求，I期临床阶段限值基于探索性最大给药剂量设定，II/III期及上市后限值基于最终确证的临床最大给药方案设定。2.4方法科学可溯源原则限值确定的所有参数选取、计算过程、调整依据均需有明确的科学证据支持，完整留存原始记录及验证数据，接受监管机构核查。3核心计算方法与参数要求3.1通用计算公式细菌内毒素限值通用计算公式为：L=K/M其中：L为细菌内毒素限值，单位可根据产品剂型标注为EU/mg、EU/ml、EU/剂、EU/细胞数、EU/病毒滴度单位等；K为给药途径对应的人体内毒素耐受阈值，单位为EU/(kg·h)；M为单位体重每小时的最大给药剂量，单位根据剂型对应为mg/(kg·h)、ml/(kg·h)、剂/(kg·h)、细胞数/(kg·h)等。3.2核心参数选取规则3.2.1K值选取K值需根据给药途径、适用人群、产品特性综合确定，通用基准如下：（1）全身给药途径：静脉注射、肌内注射、皮下注射、腹腔注射等进入全身循环的给药方式，普通成人适用K值为5EU/(kg·h)；新生儿、婴幼儿、肝肾功能不全患者、免疫低下人群、放化疗期肿瘤患者等敏感人群，K值下调为2.5~3EU/(kg·h)。（2）中枢给药途径：鞘内注射、脑室内注射、椎管内注射等直接接触中枢神经系统的给药方式，普通成人适用K值为0.2EU/(kg·h)，敏感人群K值下调为0.05~0.1EU/(kg·h)。（3）局部给药途径：①密闭腔隙给药（玻璃体内、关节腔内、胸膜腔内等）：K值取全身给药阈值的1/5~1/10，即0.5~1EU/(kg·h)；②黏膜给药（鼻腔、口腔、眼部滴眼等）：无破损黏膜的前提下K值取2~2.5EU/(kg·h)，破损黏膜按全身给药基准取值；③完整皮肤外用给药：内毒素无法透过完整皮肤的前提下，K值可放宽至20EU/(kg·h)，限值最高不超过20EU/g或20EU/ml。（4）特殊产品调整：疫苗、免疫调节剂、细胞治疗产品、mRNA/LNP递送类产品因本身存在免疫激活效应，可与内毒素产生协同毒性，K值需在给药途径基准值基础上下调50%~80%，预留额外安全余量。3.2.2M值选取M值需基于临床最大给药方案计算，选取规则如下：（1）体重基准：普通成人按60kg计算，儿童用药按适用人群的最低体重计算（如婴幼儿按10kg、新生儿按3kg计算），罕见病用药按已公开的适用人群平均体重计算。（2）给药时长：给药时长小于1h的统一按1h计算，避免短时间高浓度内毒素暴露的毒性被低估；持续输注超过1h的按实际输注时长计算，取每小时平均给药剂量。（3）给药方案选择：存在多个给药方案的，选取给药剂量最大、频次最高的方案计算；联合给药的产品，需按总内毒素暴露不超过阈值的要求，根据各产品给药剂量占比分配K值，确保联合用药时总暴露量符合要求。（4）临床前阶段M值：按毒理试验的最大给药剂量计算，确保毒理试验中动物出现的不良反应与内毒素无关。3.3典型计算示例3.3.1普通成人静脉用单抗：临床最大给药剂量为20mg/kg，单次输注时长1h，适用人群无免疫抑制，K=5EU/(kg·h)，M=20mg/(kg·h)，则L=5/20=0.25EU/mg，预留2倍安全余量后最终限值设为0.125EU/mg。3.3.2儿童用灭活疫苗：适用人群为3~12岁儿童，平均体重30kg，单次给药0.5ml/剂，肌内注射，因疫苗协同免疫刺激K值取1EU/(kg·h)，给药时长<1h按1h计算，M=0.5ml/(30kg·h)=0.0167ml/(kg·h)，则L=1/0.0167≈60EU/剂，预留2倍安全余量后最终限值设为30EU/剂。3.3.3鞘内给药基因治疗产品：成人单次给药剂量为1e12vg/次，60kg体重，给药时长<1h，K值取0.1EU/(kg·h)（敏感人群+中枢给药下调），M=1e12vg/(60kg·h)≈1.67e10vg/(kg·h)，则L=0.1/(1.67e10)≈6e-12EU/vg，即6EU/1e12vg，预留10倍安全余量后最终限值设为0.6EU/1e12vg。3.3.4人血白蛋白：临床最大输注剂量为50g/次，对应制剂规格为20%白蛋白250ml，输注时长2h，60kg成人，适用人群多为肝肾功能不全患者，K值取2.5EU/(kg·h)，M=250ml/(60kg·2h)≈2.08ml/(kg·h)，则L=2.5/2.08≈1.2EU/ml，预留5倍安全余量后最终限值为0.24EU/ml，符合中国药典不高于0.5EU/ml的要求。4分阶段限值确定要求4.1临床前研究阶段本阶段限值需同时满足两个要求：一是按毒理试验最大给药剂量计算的限值，确保毒理试验中动物出现的不良反应与内毒素无关；二是不得宽于未来临床拟用限值的1.5倍，避免后期临床阶段因限值收紧导致生产工艺大幅调整。若产品为创新型生物制品无临床给药方案参考，可按同类已上市产品的最严格限值设定，或按预期最大给药剂量的2倍计算限值。4.2I期临床试验阶段本阶段给药剂量为探索性范围，需按I期拟用的最大给药剂量计算限值，预留至少2倍安全余量，不得直接采用临床前阶段的宽松限值。若I期试验涉及敏感人群（如肿瘤患者、婴幼儿），需在基准K值基础上进一步下调，安全余量不低于5倍。4.3II/III期临床试验阶段本阶段临床给药方案已基本确定，需按最终拟申报上市的最大给药方案计算限值，该限值原则上需与上市后质量标准一致，无特殊理由不得调整。若II/III期试验中调整了给药剂量、给药途径或适用人群，需重新计算限值并补充验证数据。4.4上市后阶段上市后发生以下变更时需重新评估限值：一是给药剂量增加、给药频次提高、给药途径变更、适用人群扩大至敏感人群；二是生产工艺发生可能影响内毒素水平的重大变更；三是上市后不良反应监测发现疑似内毒素相关的不良事件（发热、寒战、低血压、弥漫性血管内凝血等）。重新评估后的限值不得宽于原标准，若需放宽需提交充分的临床安全性数据支持。5特殊类生物制品的限值确定要求5.1疫苗类生物制品疫苗类产品因本身可激活固有免疫，与内毒素的炎症效应存在协同作用，需额外提高安全要求：灭活疫苗、重组蛋白疫苗、多糖结合疫苗的K值取1~2EU/(kg·h)，mRNA疫苗、载体疫苗、佐剂疫苗的K值取0.5~1EU/(kg·h)，减毒活疫苗需区分生产工艺污染的外源性内毒素与菌株本身的内毒素组分，外源性内毒素限值需额外加5倍安全余量。若疫苗接种后38℃以上发热率高于同类产品10%以上，需进一步收紧内毒素限值。5.2血液制品血液制品适用人群多为免疫低下、肝肾功能异常的患者，且存在大剂量输注场景（如人血白蛋白单次输注量可达20~50g，静注免疫球蛋白单次输注量可达0.4~2g/kg），K值需下调至2~3EU/(kg·h)，安全余量不低于5倍。按药典要求，人血白蛋白的内毒素限值不得高于0.5EU/ml，静注人免疫球蛋白的内毒素限值不得高于0.6EU/mg，凝血因子类产品的内毒素限值不得高于1EU/国际单位。5.3细胞与基因治疗产品细胞治疗产品（CAR-T、CAR-NK、干细胞等）适用人群多为晚期肿瘤、免疫功能异常患者，内毒素暴露可加重细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）风险，K值需下调至1~2EU/(kg·h)，按细胞数标注的限值不得高于1EU/1e6个活细胞。基因治疗产品（AAV、溶瘤病毒等）若采用静脉给药K值取1~2EU/(kg·h)，若采用中枢给药K值取0.05~0.1EU/(kg·h)，安全余量不低于10倍。细胞产品的冻存液、复苏液、输注辅料的内毒素需纳入总暴露量计算，不得单独评估。5.4体内诊断类生物制品体内诊断用生物制品（如PET显像单抗、过敏原皮试制剂等）给药剂量较小，但需考虑假阳性反应风险，K值取3~4EU/(kg·h)，限值需确保给药后无内毒素相关的发热、局部红肿反应，避免干扰诊断结果判读。5.5局部用生物制品眼科玻璃体内注射产品因中枢暴露风险高，K值取0.1EU/(kg·h)，限值不得高于0.5EU/ml；吸入用生物制品因肺部黏膜敏感性高，K值取1~2EU/(kg·h)，限值不得高于1EU/ml；破损皮肤用生物制品按静脉给药要求设定限值，完整皮肤外用产品限值最高不超过20EU/g。6限值验证与调整规则6.1方法学验证计算得到的限值需通过细菌内毒素检查法的适用性验证，按照《中国药典》通则1143的要求开展干扰试验，确认在限值对应的供试品浓度下，内毒素回收率在50%~200%范围内，无抑制或增强干扰。若存在干扰无法排除，需调整供试品稀释倍数或采用更灵敏的重组C因子检测方法，必要时适当收紧限值以满足方法学要求。6.2安全性验证创新型生物制品、限值调整的产品需开展安全性验证：一是兔热原试验，按临床最大给药剂量的3倍给药，3只试验兔体温升高均低于0.6℃，且总和低于1.4℃；二是小鼠内毒素毒性试验，按限值的10倍剂量给药，72h内无动物死亡、无急性毒性反应。对于特殊人群用药，需采用对应的疾病动物模型开展安全性验证。6.3限值调整规则仅当存在以下充分证据时可适当放宽限值：一是至少100例健康志愿者及目标适应症患者的临床试验数据显示，内毒素暴露超出常规阈值但无相关不良反应；二是生产工艺无法达到常规限值要求，且临床获益远大于内毒素暴露风险。放宽限值需提交完整的暴露评估及安全性数据，经监管机构审评批准后方可执行。存在以下情形时需直接收紧限值：一是产品存在与内毒素的协同毒性反应；二是连续6个月生产批次的内毒素水平波动超过限值的50%，需预留质量控制余量；三是上市后监测发现10例以上明确与内毒素相关的不良反应。收紧限值无需额外提交临床数据，仅需提供工艺验证及方法学验证数据即可。7申报与记录要求7.1申报资料要求药品注册申报时需提交完整的内毒素限值确定研究资料，包括：临床给药方案的依据、K值选取的理由、限值计算过程、特殊调整的科学证据、方法学验证报告、安全性验证报告、分阶段限值调整说明等。联合用药的产品还需提交联合给药时的总内毒素暴露评估报告。7.2记录留存要求限值确定的所有原始数据（包括给药方案调研、计算过程、验证试验原始记录、变更评估报告等）需完整留存至产品退市后5年，接受监管机构的延伸检查。8附则8.1本指南为试行技术文件，执行过程中若与国家发布的药典标准、监管指导原则不一致，以最新官方要求为准。8.2本指南参考依据包括：《中国药典》2025年版通则1143《细菌内毒素检查法》、USP<85>BacterialEndotoxinsTest、EP2.6.14BacterialEndotoxins、FDA《GuidanceforIndustry: