生物制品硝酸盐测定指南（试行）

生物制品硝酸盐测定指南（试行）本指南适用于疫苗、抗血清、重组蛋白制剂、血液制品、体外诊断用生物制品等各类生物制品的原料、中间品、成品中硝酸盐含量的定性筛查与定量测定，不适用于含强氧化性或强还原性基质的生物制品检测。

规范性引用文件

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GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

中华人民共和国药典2025年版三部通则0701氮测定法、通则3101氯化物测定法

WHO生物制品质量控制指南（2023版）

术语和定义

3.1硝酸盐：本指南中硝酸盐以硝酸根离子（NO₃⁻）计，单位为mg/L（液体样品）或mg/kg（固体样品）。

3.2检出限：指特定分析方法在给定置信度下能够从样品中检出待测物的最小浓度，本指南中检出限对应99%置信水平下的空白信号加3倍标准差对应的浓度。

3.3定量限：指特定分析方法能够准确定量测定待测物的最小浓度，对应空白信号加10倍标准差对应的浓度，且定量限处测定结果的相对标准偏差≤10%。

3.4还原效率：指镉柱将硝酸盐还原为亚硝酸盐的比例，计算公式为：R(%)=（还原后测得的亚硝酸盐质量×62/46）/加入的硝酸盐质量×100%，其中62为NO₃⁻摩尔质量（g/mol），46为NO₂⁻摩尔质量（g/mol）。

测定原理

4.1定性筛查原理（二苯胺法）

硝酸盐在浓硫酸酸性条件下与二苯胺发生氧化还原反应，生成蓝色亚胺型醌式化合物，颜色深浅与硝酸盐浓度正相关，可用于硝酸盐的快速定性筛查，检出限为1mg/L。高浓度亚硝酸盐会产生黄色干扰，可通过氨基磺酸预处理消除。

4.2定量测定第一法（镉柱还原分光光度法，经典法）

样品经前处理去除蛋白、佐剂等基质干扰后，通过镉柱将硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与对氨基苯磺酰胺发生重氮化反应，再与N-1-萘基乙二胺盐酸盐偶合生成紫红色偶氮染料，在540nm波长处测定吸光度定量。扣除样品本底亚硝酸盐含量后，即可得到硝酸盐含量，本方法检出限0.01mg/L，定量限0.03mg/L。

4.3定量测定第二法（离子色谱法，仲裁法）

样品经前处理去除杂质、过膜后，通过阴离子交换色谱柱分离硝酸盐与其他阴离子组分，经抑制型电导检测器检测，根据保留时间定性、峰面积定量。本方法抗干扰能力强，准确度高，检出限0.005mg/L，定量限0.02mg/L，为仲裁检测方法。

4.4定量测定第三法（紫外分光光度法，快速法）

硝酸盐在220nm波长处有特征紫外吸收，样品中可溶性有机物在220nm和275nm波长处均有吸收，而硝酸盐在275nm处无吸收，通过校正公式A=A₂₂₀-2A₂₇₅扣除有机物干扰后，根据校正吸光度定量。本方法操作快速、无需显色，适用于基质简单的样品检测，检出限0.02mg/L，定量限0.06mg/L。

试剂与材料

所有试剂除另有说明外均为优级纯，实验用水符合GB/T6682-2008规定的一级水，且无硝酸盐、亚硝酸盐残留。

5.1通用试剂

5.1.1浓硫酸（ρ=1.84g/mL）

5.1.2盐酸（ρ=1.19g/mL）

5.1.3氢氧化钠

5.1.4氯化铵

5.1.5乙酸锌

5.1.6亚铁氰化钾

5.1.7三氯乙酸

5.1.8柠檬酸三钠

5.1.9氨基磺酸

5.1.10乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）

5.2定性测定试剂

二苯胺硫酸溶液：称取1.0g二苯胺，加入100mL浓硫酸中，搅拌至完全溶解，贮存于棕色磨口瓶中，4℃避光保存，有效期1个月。

5.3镉柱还原分光光度法试剂

5.3.10.1mol/L盐酸溶液：量取8.3mL浓盐酸，用水稀释至1000mL，混匀。

5.3.2氯化铵缓冲液（pH9.6）：称取20g氯化铵，用500mL水溶解，加入10mL浓氨水，调pH至9.6，用水定容至1000mL。

5.3.310%乙酸锌溶液：称取10g乙酸锌，加少量水溶解，加入0.5mL冰乙酸，用水定容至100mL。

5.3.410%亚铁氰化钾溶液：称取10g亚铁氰化钾，用水溶解定容至100mL。

5.3.50.5%对氨基苯磺酰胺溶液：称取0.5g对氨基苯磺酰胺，溶于100mL1mol/L盐酸溶液中，贮存于棕色瓶，4℃保存，有效期3个月。

5.3.60.1%N-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液：称取0.1gN-1-萘基乙二胺盐酸盐，溶于100mL水中，贮存于棕色瓶，4℃保存，有效期1个月。

5.3.7硝酸盐标准贮备液（100μg/mL，以NO₃⁻计）：准确称取120℃干燥至恒重的硝酸钾（基准试剂）0.1631g，用水溶解后定容至1000mL，加入2mL三氯甲烷作为防腐剂，4℃棕色瓶保存，有效期6个月。也可直接使用有证标准物质。

5.3.8硝酸盐标准工作液（1μg/mL）：临用前取1.0mL硝酸盐标准贮备液，用水定容至100mL，混匀。

5.3.9亚硝酸盐标准贮备液（100μg/mL，以NO₂⁻计）：准确称取110℃干燥至恒重的亚硝酸钠（基准试剂）0.1500g，用水溶解定容至1000mL，4℃棕色瓶保存，有效期3个月。

5.3.10亚硝酸盐标准工作液（1μg/mL）：临用前取1.0mL亚硝酸盐标准贮备液，用水定容至100mL，混匀。

5.4离子色谱法试剂

5.4.1淋洗液（氢氧根体系）：20mmol/L氢氧化钾溶液，由淋洗液自动发生器制备，或准确称取1.12g氢氧化钾（基准级），用无二氧化碳的水溶解定容至1000mL，经0.22μm滤膜过滤、超声脱气后使用。

5.4.2淋洗液（碳酸盐体系）：3.2mmol/L碳酸钠+1.0mmol/L碳酸氢钠溶液，称取0.3392g无水碳酸钠、0.0840g碳酸氢钠，用无二氧化碳的水溶解定容至1000mL，经0.22μm滤膜过滤、超声脱气后使用。

5.4.30.22μm水系微孔滤膜。

5.4.4C18固相萃取小柱、银型预处理柱。

5.5紫外分光光度法试剂

1mol/L盐酸溶液：量取83mL浓盐酸，用水稀释至1000mL，混匀。

仪器与设备

6.1分析天平：感量0.1mg，符合GB/T26497要求。

6.2分光光度计：配备1cm石英比色皿，波长范围190~800nm，定期校准波长、吸光度准确度。

6.3离子色谱仪：配备阴离子抑制器、电导检测器，工作站支持色谱峰积分、标准曲线拟合功能。

6.4镉柱还原装置：玻璃柱内径1cm，柱长20cm，内装高度15cm的海绵镉层，上下两端填充玻璃棉固定。

6.5高速冷冻离心机：最高转速≥12000r/min，控温范围4~40℃。

6.6恒温水浴锅：控温精度±1℃。

6.7超声波清洗器：功率≥200W。

6.8pH计：精度±0.01pH单位。

6.9常规玻璃器皿：容量瓶、移液管、比色管等，经10%硝酸浸泡24h后，用无硝酸盐的水冲洗干净备用。

测定步骤

7.1定性筛查（二苯胺法）

7.1.1样品前处理

7.1.1.1低基质液体样品：如纯化水、缓冲液、无蛋白制剂稀释液，可直接取样检测。

7.1.1.2含蛋白、佐剂的样品：取1.0mL样品，加入0.5mL0.5mol/L柠檬酸三钠溶液（含铝佐剂样品适用），60℃水浴10min解吸附，加入1mL10%乙酸锌溶液、1mL10%亚铁氰化钾溶液，振荡混匀3min，4℃10000r/min离心10min，取上清液待测。若样品亚硝酸盐本底≥50mg/L，向上清液中加入0.1g氨基磺酸，振荡反应5min后再测定。

7.1.2测定步骤：取10μL待测液滴加于白瓷板上，加入2滴二苯胺硫酸溶液，立即观察颜色变化。

7.1.3结果判定：溶液显蓝色为硝酸盐阳性，蓝色越深浓度越高；溶液显无色或淡紫色为阴性，即硝酸盐含量<1mg/L。阳性样品需进一步做定量测定。

7.2镉柱还原分光光度法

7.2.1镉柱还原效率验证：每次测定前需验证镉柱还原效率，取20mL1μg/mL硝酸盐标准工作液，以2~3mL/min的流速过镉柱，收集流出液于25mL比色管中，用少量水冲洗镉柱3次，合并流出液定容至25mL。取10mL流出液按照7.2.3的显色步骤测定亚硝酸盐含量，计算还原效率，还原效率≥95%方可使用；若还原效率<90%，需用0.1mol/L盐酸浸泡镉柱30min，用水冲洗至中性后重新验证，合格后方可使用。镉柱使用过程中需保持液面高于镉层，避免气泡进入，长期不用时浸泡于水中4℃保存。

7.2.2样品前处理

7.2.2.1低基质液体样品：直接取适量样品，若硝酸盐浓度在0.03~1mg/L范围内可直接测定，超出范围则用一级水适当稀释。

7.2.2.2含铝佐剂疫苗样品：取1.0mL样品，加入0.5mL0.5mol/L柠檬酸三钠溶液，振荡混匀，60℃水浴10min解吸附，加入1mL10%乙酸锌、1mL10%亚铁氰化钾溶液，振荡3min，4℃10000r/min离心10min，取上清液用氯化铵缓冲液定容至10mL待测。

7.2.2.3血液制品、重组蛋白制品：取0.5g（或0.5mL）样品，加5mL水溶解，加入2mL20%三氯乙酸溶液，振荡混匀，静置10min沉淀蛋白，4℃12000r/min离心15min，取上清液用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0~7.5，定容至10mL待测。

7.2.2.4固体辅料：准确称取1.0g样品（精确至0.0001g），加20mL水充分溶解，按含蛋白样品前处理步骤操作，不含蛋白的辅料可直接定容过滤后测定。

7.2.3标准曲线制备：分别取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL1μg/mL硝酸盐标准工作液于25mL比色管中，加水至20mL，以2~3mL/min流速过镉柱，收集流出液定容至25mL。分别取10mL上述溶液，加入2mL0.5%对氨基苯磺酰胺溶液，混匀后暗处放置5min，加入1mL0.1%N-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液，混匀后暗处放置15min，用1cm比色皿在540nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、硝酸盐浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，标准曲线相关系数≥0.999。

同时制备亚硝酸盐标准曲线：分别取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL1μg/mL亚硝酸盐标准工作液于25mL比色管中，加水定容至10mL，按上述显色步骤测定吸光度，绘制亚硝酸盐标准曲线。

7.2.4样品测定：取20mL处理好的样品溶液，按标准曲线制备步骤过柱、显色、测定吸光度，得到总亚硝酸盐对应的硝酸盐浓度C1；另取10mL处理好的样品溶液，不过镉柱，直接显色测定吸光度，通过亚硝酸盐标准曲线得到本底亚硝酸盐浓度C2，按照系数62/46换算为等效硝酸盐浓度。

7.2.5空白试验：用同体积一级水代替样品，按样品前处理、测定步骤同步操作，得到空白浓度C0。

7.3离子色谱法（仲裁法）

7.3.1色谱条件：阴离子交换柱（如DionexIonPacAS19，4mm×250mm或等效柱），柱温30℃，流速1.0mL/min（氢氧根体系）或1.2mL/min（碳酸盐体系），进样体积25μL，抑制器电流75mA（氢氧根体系）或50mA（碳酸盐体系），电导检测器灵敏度设置为0.1μS/cm。

7.3.2标准曲线制备：将硝酸盐标准贮备液稀释为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0mg/L的系列标准工作液，依次进样，记录保留时间与峰面积，以峰面积为纵坐标、硝酸盐浓度为横坐标绘制标准曲线，相关系数≥0.999。

7.3.3样品前处理：同7.2.2步骤，处理后的上清液依次过0.22μm水系滤膜、C18固相萃取小柱，弃去前3mL流出液，收集后续流出液待测。若样品中Cl⁻浓度≥100mg/L，需先过银型预处理柱去除氯离子后再进样。

7.3.4样品测定：将处理好的样品溶液进样，记录保留时间定性、峰面积定量，同步做空白试验。

7.4紫外分光光度法

7.4.1标准曲线制备：分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL10mg/L硝酸盐标准工作液于50mL比色管中，加入1mL1mol/L盐酸溶液，用水定容至刻度，混匀。用1cm石英比色皿，分别在220nm和275nm波长处测定吸光度，计算校正吸光度A=A₂₂₀-2×A₂₇₅，以校正吸光度为纵坐标、硝酸盐浓度（mg/L）为横坐标绘制标准曲线，相关系数≥0.999。

7.4.2样品前处理：同7.2.2步骤，处理后的上清液需澄清无色，无可见杂质，取适量样品溶液于50mL比色管中，加入1mL1mol/L盐酸溶液，定容至刻度，混匀待测。

7.4.3样品测定：按标准曲线步骤测定A₂₂₀和A₂₇₅，计算校正吸光度，查标准曲线得到样品浓度，同步做空白试验。

结果计算

8.1镉柱还原分光光度法

样品中硝酸盐含量X按式（1）计算：

式中：

X——样品中硝酸盐含量，单位为mg/L（液体样品）或mg/kg（固体样品）；

C1——样品过柱后从硝酸盐标准曲线查得的浓度，单位为μg/mL；

C0——空白试验从硝酸盐标准曲线查得的浓度，单位为μg/mL；

C2——样品本底从亚硝酸盐标准曲线查得的亚硝酸盐浓度，单位为μg/mL；

62/46——亚硝酸盐换算为等效硝酸盐的系数；

V——样品定容体积，单位为mL；

f——样品稀释倍数；

m——样品取样量，单位为mL（液体）或g（固体）；

R——镉柱还原效率，单位为%。

8.2离子色谱法、紫外分光光度法

样品中硝酸盐含量X按式（

式中：

X——样品中硝酸盐含量，单位为mg/L或mg/kg；

C——样品溶液中硝酸盐浓度，单位为mg/L；

C0——空白溶液中硝酸盐浓度，单位为mg/L；

V——样品定容体积，单位为mL；

f——稀释倍数；

m——取样量，单位为mL或g。

质量控制要求

9.1平行样控制：每批样品需做平行双样测定，平行样测定结果的相对偏差≤10%，超出范围需重新测定。

9.2质控样控制：每20个样品需插入1个有证硝酸盐质控样，质控样测定值需在标示值的±10%范围内，否则本次测定结果无效，需排查原因后重新测定。

9.3空白控制：每批测定需做2个试剂空白，空白值不得超过对应方法的检出限，否则说明试剂或器皿被污染，需更换试剂、重新清洗器皿后测定。

9.4加标回收控制：每批样品至少选取1个代表性样品做加标回收试验，镉柱法回收率需在90%105%之间，离子色谱法回收率需在95%105%之间，紫外法回收率需在85%~110%之间，超出范围需重新处理样品测定。

干扰与消除

10.1亚硝酸盐干扰：镉柱法测定时需扣除本底亚硝酸盐含量，定性试验时高浓度亚硝酸盐可通过加入氨基磺酸反应去除。

10.2氯离子干扰：离子色谱法中Cl⁻浓度≥100mg/L时会出现峰拖尾掩盖硝酸盐峰，需通过银