CN119451977A L-组氨酸输出蛋白质及用其生产l-组氨酸的方法 （Cj第一制糖株式会社）

2024.12.23PCT/KR2023/0086562023.06.22WO2023/249421KO2023.12.28L-组氨酸输出蛋白质及用其生产L-组氨酸本申请公开了一种组氨酸输出蛋白质或其2(1)对应于SEQIDNO:43的氨基酸序列的第72位氨基酸残基的氨基酸被另一种氨基酸(2)对应于SEQIDNO:43的氨基酸序列的第124位残基的氨基酸被另一种氨基酸取代，或其中(1)对应于SEQIDNO:43的氨基酸序列的第72位氨基酸残基的氨基酸被亮氨酸、3.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质与SEQIDNO:56的氨基酸序列具有5.一种微生物，其包含权利要求1至3中任一项所所述的蛋白质或编码所述蛋白质的多核苷酸的3[0006]当具有不同种类氨基酸输出能力的蛋白质的表达和/或功能增强时，相应氨基酸[0010](2)对应于SEQIDNO:43的氨基酸序列的第124位残基的氨基酸被另一种氨基酸[0012]本申请的另一个目的是提供一种包含该蛋白质或编码该蛋白质的多核苷酸的微4输出活性。含AzlD结构域的蛋白质或AzlC家族ABC转运体渗透酶蛋白质可来源于马赛创伤质(或HmaE)，来源于马赛创伤杆菌的AzlC家族ABC转[0024]在一个实施方案中，所述突变型蛋白质可以是来源于马赛创伤杆菌的AzlC家族[0025]所述突变型蛋白质可以是其中来源于马赛创伤杆菌的野生型AzlC家族ABC转运体[0026]来源于马赛创伤杆菌的野生型AzlC家族ABC转运体渗透酶蛋白质可包含SEQID56其中对应于SEQIDNO:56的氨基酸序列中从N一末端起第72位和/或第124位残基的氨基酸[0040]在一个实施方案中，所述突变型蛋白质可能比野生型蛋白质(例如，含有野生型[0041]野生型L组氨酸输出蛋白质可以是与SEQIDNO:43(来源于马赛创伤杆菌的野生序列编码，或者SEQIDNO:43和/或SEQIDNO:44代表的蛋白质可以由SEQIDNO:47(在[0044]编码本申请突变型蛋白质的多核苷酸可以包含编码SEQIDNO:56的氨基酸序列酸或多肽的原始功能和/或所需功能的范围内，对特定的核酸序列或氨基酸序列施加突变7核酸序列或氨基酸序列组成”可能意味着所述多核苷酸或多肽(i)基本上包含特定的核酸微生物中优选的密码子，可以在不改变编码区表达的蛋白质的氨基酸序列和/或功能的范Pearson的FASTA算法(参见：MethodsEnzymol.,183,63,1990)来确定。基于这种算法[0050]多核苷酸或载体的导入可以通过本领域技术人员适当选择已知的转化方法来进8核苷酸可以包含编码靶蛋白质的DNA和/或RNA。只要该多核苷酸可以被导入宿主细胞并表能性地连接，使得表达调控元件对编码靶蛋白质(外源蛋白质)的多核苷酸进行转录调控[0052]将多核苷酸转化到宿主细胞中的方法可以通过将核酸导入细胞(微生物)的任何[0053]多核苷酸向宿主细胞基因组(染色体)的导入(插入)可通过本领域技术人员适当重组载体可用于将多核苷酸插入宿主细胞的基因组中，或取代宿主细胞基因组的相应基[0057]可用于本说明书的载体可以是已知的表达载体和/或用于将多核苷酸插入宿主细9码该突变型蛋白质的多核苷酸和包含该多核苷酸的重组载体组成的组中的至少一种的微杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、热产氨棒状杆菌达突变型蛋白质的突变可以通过导入编码上述突变型蛋白质的多核苷酸或包含该多核苷亲本菌株的编码突变型蛋白质的多核苷酸如此可以取代本菌株中编码AzlC家族ABC转运体[0070]在一个实施方案中，当微生物包含突变型蛋白质和野生型AzlC家族ABC转运体渗[0079]导入突变可以包括将编码突变型蛋白质的多核苷酸或包含该多核苷酸的重组载L组氨酸输出活性和/或L组氨酸生产能力的微生物。该方法可进一步包括在培养后从培[0082]可用于培养的培养基可以单独使用至少一种或组合使用至少两种选自由糖和碳[0089]其中，考虑到生物安全等级以及确保达到适用于在其中生产菌株的水平的可能[0096]实施例2.导入外源L_组氨酸输出基因候选物的载体及导入相同基因候选物的重[0097]生产了六种载体，用于将实施例1中选出的六种外源L_组氨酸输出基因候选物导的NCgl2131基因用作插入位点(JournalofBiotechnology104,5_25JornKalinowski[0100]为了用输出基因取代NCgl2131基因，生产了NCgl2131缺失和靶基因插入的载为了生产所述载体，以谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13032的染色体为模板，分别使用SEQIDNO:18和SEQIDNO:19以及SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的引物对进行PCR。作为用于PCR钟的结果，分别获得531bp的del_N2131L(SEQIDNO:22)和555bp的del_N2131R(SEQID[0102]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码水草螺菌来源的蛋白质2分钟，重复28次，然后在72℃聚合5分钟的结果，获得包含945bp的haq(SEQIDNO:2)的的引物对，以ATCC13032的染色体为模板进行PCR。作为用于PCR反应的聚合酶，使用409bp的PgapA(SEQIDNO:17)的441bp的PgapA片段。使用Gibson组装(DGGibsonetal.,NATUREMETHODS,VOL.6NO.5,MAY2009,NEBuilderHiFiDNAAssemblyMasterMix)方法[0103]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码贪铜菌来源的蛋白质(下贪铜菌来源的cpi，使用SEQIDNO:28和SEQIDNO:29的引物对，以贪铜菌菌株[0104]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码栖冷克吕沃尔菌来源的[0105]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码停滞棒状杆菌来源的蛋杆菌菌株(ATCC6872)的染色体DNA为模板，进行PCR。作为用于PCR反应的聚合酶，使用717bp的cst(SEQIDNO:8)的749bp的cst片段。为了获得可与cst连接的PgapA片段，使用[0106]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码萨尔西修斯亮杆菌来源板进行PCR。作为用于PCR反应的聚合酶，使用PfuUltraTM高可靠性DNA聚合酶[0107]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码阴道皮肤杆菌来源的蛋℃聚合5分钟的结果，获得包含409bp的PgapA(SEQIDNO:17)的441bp的PgapA片段。使用Gibson组装方法克隆获得的dva片段和PgapA片段以及用ScaI限制性酶切割的pDZΔN2131缺失载体(pDZΔN2131)以及6种导入外源L_组氨酸输出基因候选物的载体(pDZΔN2131_分别被命名为ATCC13032ΔN2131(N2131基因缺失)、ATCC13032ΔN2131::Haq(用haq取代kcr取代N2131基因)、ATCC13032ΔN2131::Cst(用cst取代N2131基因)、ATCC13032ΔN2131::Lsa(用lsa取代N2131基因)和ATCC13032ΔN2131:[0111]为了证实在上面的实施例2中生产的7种重组谷氨酸棒状杆菌菌株(ATCC13032ΔN2131、ATCC13032ΔN2131::Haq、ATCC13032ΔN2131::Cpi、ATCC13032ΔN2131::Kcr、)2SO4[0118]导入外源L_组氨酸输出基因候选物的棒状杆菌属菌株在包含L_组氨酸的基本培出候选基因的菌株的生长是不明显的，并且只有导入了阴道皮肤杆菌来源的基因的[0125]由此，选择阴道皮肤杆菌来源的蛋白质Dva作为能够使棒状杆菌菌株对超过最低[0126]实施例4.基于棒状杆菌来源的L一组氨酸生产菌株(KC氨酸输出基因候选物(dva)取代的两种菌株，并分别将其命名为KCCM80179ΔN2131PgapADva菌株在活化培养基中培养16小时，然后将每种菌株接种到含有25mL种子培养基[0140]如上表3所示，证实了NCgl2131缺失菌株具有与亲本菌株KCCM80179菌株相当水[0143]由于在上述实施例3和4中证实了阴道皮肤杆菌来源的蛋白质的L一组氨酸输出能[0152]生产用于将在实施例5中另外选择的2种L一组氨酸输出基因候选物导入棒状杆菌[0153]从美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)获得编码马赛创伤杆菌来源的蛋含1081bp的hma(SEQIDNO:47)的1113bp的hma片段。为了获得可与hma连接的PgapA片段，聚合5分钟的结果，获得包含409bp的PgapA(SEQIDNO:17)的441bp的PgapA片段。使用Gibson组装方法克隆获得的hma片段和PgapA片段以及用ScaI限制性酶切割的pDZΔN2131[0154]实施例7.基于L一组氨酸生产菌株(KCCM8[0156]为此，通过电穿孔将实施例6中生产的载体pDZΔN2131一PgapA一Hma转化到[0164]为了获得具有增加的L_组氨酸输出能力的突变型Hma，生产了用于初级交叉的突纵子。对于易错PCR，在每1kb向扩增的基因片段中导入0至3.5个突变的条件下，使用MAY2009,NEBuilderHiFiDNAAssemblyMasterMix)方法克隆获得的突变型hma操纵子ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_7000。[0168]葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛选择生长良好的菌落。作为对照组，使用生产的ATCC13032ΔN2131菌株和ATCC13032Δ)2SO4[0175]通过实施例3中进行的方法对选择的36个菌落进行基于固体培养基的筛选，并对[0183]如上面的表7所示，NCgl2131缺失的菌株(ATCC13032ΔN2131)不能在包含1g/L的L_组氨酸的基本培养基中平稳生长，但是其中导入了马赛创伤杆菌来源的基因的菌株(ATCC13032ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_1216、ATCC13032ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_2305、ATCC13032ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_3411、ATCC13032ΔN2131_PgapA_Hma(mt)ATCC13032ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_5714和ATCC13032ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_6718菌株)的生长水平高于包含1g/L组氨酸的基本培养基中的生长[0184]实施例10.导入基于棒状杆菌来源的L_组氨酸生产菌株(KCCM80179)选择的文库[0185]生产用于将实施例9中选择的6种菌落包含的突变型hma导入L_组氨酸生产菌株的(mt)_1216、ATCC13032ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_2305、ATCC13032ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_3411、ATCC13032ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_4426、ATCC13032ΔN2131_PgapA_Hma为了获得可与突变型hma连接的PgapA片段，使用SEQIDNO:26和SEQIDNO:50的引物对，克隆获得的6种突变型hma片段和PgapA片段以及用ScaI限制性酶切割的pDZΔN2131载体，PgapA_Hma(mt)_1216、KCCM80179ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_2315、KCCM80179ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_3411、KCCM80179ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_4426、KCCM80179ΔN2131_[0187]为了证实所生产的6种菌株的L_组氨酸生产能力，使用实施例7中生产的KCCM80179菌株水平的L_组氨酸生产能力，但是与NCgl2131缺失菌株和亲本菌株KCCM80179菌株相比，其中导入了马赛创伤杆菌来源的基因的ATCC13032ΔN2131::Hma菌株具有增加的型hma的6种菌株具有相当于或高于KCCM80179ΔN2131_PgapA_Hma菌株的L_组氨酸生产能变型HmaFE是具有增加的L_组氨酸输出能力的[0200]实施例12.基于L_组氨酸生产菌株(CA14_737)的导入了马赛创伤杆菌来源的基因[0201]为了证实马赛创伤杆菌来源的蛋白质Hma突变体的L_组氨酸输出能力，将其导入到来源于野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的L_组氨酸生产菌株CA14_737(KCCM12411P，韩国专利公开号10_2019_0065984)菌株中，在该菌株中导入了HisG多肽突变(其中通过L_[0202]为此，通过电穿孔将实施例2和10中生产的3种载体(pDZΔN2131、pDZΔN2131_N2131_PgapA_Hma(mt)_6718菌株的L_组氨酸生产能力，通过实施例4中进行的方法培养它[0205]导入了CA14_737来源的马赛创伤杆菌来源的野生型基因和变体的菌株的L_组氨[0207]如表10所示，与NCgl2131缺失菌株(CA14_737ΔN2131)和亲本菌株CA14_737菌株相比，其中导入了马赛创伤杆菌来源的基因的CA14_737ΔN2131_PgapA_Hma菌株的L_组氨酸产量增加了54并且CA14_737ΔN2131_PgapA_Hma(mt)_6718菌株(其中导入了突变型[0209]实施例13.用于表达马赛创伤杆菌来源的野生型基因和变体的大肠杆菌载体的生产[0210]为了证实马赛创伤杆菌来源的蛋白质Hma和