CN119452090A 用于由c1底物连续共产生串联重复蛋白和化学产物的微生物和方法 （朗泽科技有限公司）

2024.12.19PCT/US2023/0688212023.06.21WO2023/250382EN2023.12.28用于由C1底物连续共产生串联重复蛋白和别是通过气态底物的微生物发酵来连续共产生21.一种能够由气态底物共产生至少一种异源蛋白和至少一种化学产物的经基因工程2.根据权利要求1所述的经基因工程化微生物，其中具有一个或多个串联重复序列的3.根据权利要求2所述的经基因工程化微生物，其中所述至少一种异源蛋白是SRT蛋6.根据权利要求2所述的经基因工程化微生物，其中所述具有一个或多个串联重复序8.根据权利要求1所述的经基因工程化微生物，其进一步包含一个或多个基因中的破劳特氏菌(Blautiaproducta)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、(Clostridiumdrakei)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii)、大梭菌(Clostridiummagnum)、拉氏梭菌(Clostridiumragsdalei)、粪味梭菌(Clostridiumscatologenes)、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、热自养穆尔氏菌(Moorellathermautotrophica)、热醋穆尔氏菌(Moorella森林土壤醋酸鼠孢菌(Sporomusasilvacetica)、球形鼠孢菌(Sporomusasphaeroides)、钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)和凯伍嗜热厌氧菌(Thermoanae10.一种通过以下共产生具有一个或多个串联重复序列的至少一种异源蛋白和至少一315.根据权利要求14所述的经基因工程化微生物，其中所述微生物生物质适合作为动16.根据权利要求15所述的经基因工程化微生物，其中所述动物饲料适合于喂养以下20.一种经基因工程化的C1固定型微生物，其能够由气态底物共产生至少一种异源蛋b)编码具有两个或更多个碳的至少一种化学品的异源核酸胞中累积所述至少一种异源蛋白并且从所述细胞中分泌所述至4[0002]本申请要求于2022年6月21日提交的美国临时专利申请第63/366,756号的权益，所述美国临时专利申请的全部内容通过引用[0004]本申请含有已经以ST.26序列表XML格式电子提交并且特此通过引用以其整体并入的序列表。创建于2023年5月31日的所述ST.26序列表XML命名为“LT228WO1_微生物包含编码具有串联重复序列的至少一种蛋白质的异源核酸和编码至少一种分泌的5所述微生物能够在细胞中累积所述至少一种异源蛋白并且从所述细胞中分泌所述至少一种或多种异源酶衍生自选自由以下组成的组的属：芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、贪铜菌属(Cupriavidus)、埃希氏菌属(Escherichia)、葡糖杆菌属类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、栖沉积物菌属一种异源功能蛋白和具有至少两个或更多个碳的至少一种化学产物的经基因工程化的C1一种异源功能蛋白和具有至少两个或更多个碳的至少一种化学产物的经基因工程化的C1在细胞中累积所述至少一种异源蛋白并且从所述细胞中分泌所述至[0019]一个方面包含一种通过以下共产生至少一种异源蛋白和至少一种化学产物的方2和H2中的一种或多种的气态底物的情况下培养所述经基因工程化的[0022]一方面包含通过培养所述经基因工程化的C1固定型来共产生至少一种异源蛋白6[0024]在本文公开的微生物的一些方面，所述微生物是选自由以下组成的组的属的成(Eubacterium)、穆尔氏菌属(Moorella)、产醋杆菌属(Oxobacter)、罗尔斯通氏菌属本微生物：伍氏醋酸杆菌(Acetobacteriumwoodi)、巴氏嗜碱菌(Alkalibaculumbacchii)、生产布劳特氏菌(Blautiaproducta)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacteriummethylotrophicum)、醋酸梭菌(Clostridiumaceticum)、产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、食一氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、克氏梭菌formicoaceticum)、永达尔梭菌(Clostridiumljungdahlii)、大梭菌(Clostridium菌(Oxobacterpfennigii)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)、卵形鼠孢菌(Sporomusaovata)、森林土壤醋酸鼠孢菌(Sporomusasilvacetica)、球形鼠孢菌7[0041]在一些实施例中，本公开提供了一种用于以生物聚合物的形所述方法包含在电解工艺中间歇地处理由可再生和/或不可再生能量源产生的电能的至少培养物的生物反应器，所述培养物包含液体营养培养基和能够产生生物聚合物的微生物；[0042]在一个实施例中，本公开还提供了一种用于以生物聚合物的形式储存能量的系[0043]在一些实施例中，本公开提供了一种用于改进发酵工艺的性能和/或经济性的方[0044]在另一个实施例中，本地电网基于电力的可用性或低于阈值价格的电力的可用[0045]在一个实施例中，本公开可以通过以生物聚合物的形式8[0046]在一个实施例中，自养微生物间歇地部分或全部消耗由可获得的能量提供的能[0049]图1通过蛋白质印迹示出了串联重复蛋白在产乙醇梭菌中的表达(表2)。使用抗分析澄清的裂解物和不溶性沉淀物(重悬于5M尿素中白质印迹分析相对于第5天(反应器转为连续)的每生物质的乙醇产量和SRT012蛋白含量；图2B：通过HPLC分析生物质和代谢物谱；图2C：通N2)的分批CSTR发酵中的性能。图3N2)的分批CSTR发酵中的性能。图4[0055]图7示出了具有乙烯形成酶表达(pBBR1_Efe)的钩虫贪铜菌菌株在CSTR中以CO2作9[0064]“内源”是指在衍生出本公开的微生物的野生型或亲本微生物中存在或表达的核源微生物中分离外源基因或酶并将其引入本公开的微生物中或在本公开的微生物中表达。外源核酸可以调整以整合到本公开的微生物的基因组中或在本公开的微生物中例如在质[0066]“异源”是指在衍生出本公开的微生物的野生型或亲本微生物中不存在的核酸或德氏菌(Burkholderia)、李斯特氏菌(Listeria)、不动杆菌(Acinetobacter)、志贺氏菌雷氏菌(Serratia)、克罗诺杆菌(Cronobacter)、铜杆菌(Cupriavidus)、螺杆菌(Helicobacter)、耶尔森菌(Yersinia)、角质细菌(Cutibacterium)、弗朗西斯菌(Francisella)、果胶杆菌(Pectobacterium)、弧杆菌(Arcobacter)、乳杆菌(Lactobacillus)、希瓦氏菌(Shewanella)、欧文氏菌(Erwinia)、硫脲螺旋菌(Sulfurospirillum)、肽球菌科(Peptococcaceae)、嗜热球菌(Thermococcus)、酵母菌(Ralstonia)、短杆菌(Brevibacterium)、甲基杆菌(Methylobacterium)、地芽孢杆菌(Geobacillus)、牛属(bos)、原鸡属(gallus)、厌氧球菌(Anaerococcus)、非洲爪蟾属(Acetobacterium)、嗜碱菌(Alkalibaculum)、布劳特氏菌、丁酸杆菌、真杆菌杆菌(Thermoanaerobacter)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、类芽孢杆菌杆菌(Corynebacterium)、嗜热菌(Thermaerobacter)、硫杆菌(Sulfobacillus)或共生菌码酶的基因表达的基因调节元件中的突变、引入产生降低或抑制酶活性的蛋白质的核酸、或引入抑制蛋白质或酶表达的核酸(例如，反义核RNA、RNAi、TALEN、siRNA、CRISPR或生物还可以被修饰成不表达或表达在亲本微生物中表达的较低量的一微生物可以衍生自选自由以下组成的组的亲本微生物：丙酮丁醇梭菌(ClostridiumTreaty)》的条款于2010年6月7日保藏在德国布伦瑞克省D_38124Inhoffenstraβe7B的DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(DSMZ)，并且登录号白质和其它生物营养素的价格低得多。更广泛地，氢氧混合气微生物、氢营养型生物(hydrogenotroph)、一氧化碳营养生物(carboxydotroph)和化能自养生物能够捕获CO2或一氧化碳营养生物和/或其它化能自养微生物在气体流上生长，所述气体流包括但不限于氧混合气微生物和/或氢营养型生物和/或一氧化碳营养生物和/或其它化能自养微生物和/或甲烷营养微生物将温室气体转化成包括氨基酸和蛋白质的生物菌可能会产生不良反应或甚至死亡。然而，一些厌氧菌能够耐受低水平的氧(例如，化)的机制(Drake,“产乙酸原核生物(AcetogenicProkaryotes)”,《原核生物(The呼吸作用中将氢气用作为电子供体并且将氧气用作电子受体来产生如腺苷一5'一三磷酸(IntJSystemBacteriol)》,43:232_236,1993(永达尔梭菌)；以及Huhnke,WO200的能量保存和发酵代谢模式。此外，这些物种簇集于16SrRNADNA超过99％相同的梭菌 161:345_351,1994)、LBS1560(DSM19630)(WO2009/064200)和LZ1561(DSM23693)(WO2012/015317)。永达尔梭菌的分离株和突变体包括ATCC49587(Tanner,《国际系统细菌学 6,368,819)和OTA_1(Tirado_Acevedo，利用永达尔梭菌由合成气产生生物乙醇 (ProductionofbioethanolfromsynthesisgasusingClostridiumljungdahlii),《博士论文(PhDthesis)》,北卡罗来纳州立大学(NorthCarolinaStateUniversity),2010)。拉氏梭菌的分离株和突变体包括PI1(ATCCBAA_622、028055)。菌(Cupriavidusgilardii)。在一些实施例中，需氧菌是拉哈斯贪铜菌(Cupriavidus植物贪铜菌(Cupriavidusplantarum)。在一些实施例中，需氧菌是呼吸贪铜菌(Cupriavidusrespiraculi)。在一些实施例中，需氧菌是台湾贪铜菌(Cupriavidus[0107]在一些实施例中，需氧菌包含一种或多种编码天然存在的多肽的外源核酸分子，式烯酰CoA异构酶/烯酰CoA水合酶/3羟酰基CoA脱氢酶、短链脱氢酶、反式2烯酰其任何组合。实施例的微生物，其中编码一组外源酶的核酸包含至少一种EFE和至少一种[0111]在一些实施例中，所述微生物是能够将气态底物转化为碳源和/或能量源的天然[0119]破坏性突变的引入导致本公开的微生物不产生目标产物或基本上不产生目标产[0120]尽管本文提供了酶的示例性序列和来源，但本公开决不序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键结合。如本文所使用[0123]“杂交”是指一种一个或多个多核苷酸反应形成通过在核苷酸残基碱基之间进行任意组合。杂交反应可以构成更广泛工艺(如启动的基因和/或多态性等。来自其它微生物的同源基因也可以被视为是本文具体例示的序列例如在SambrookJ、FritschEF、ManiatisT：《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:AlaboratoryManual)》冷泉港冷泉港出版社(ColdSpringHarbour将如本文所描述的表达构建体/载体的(i)和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载[0133]穿梭微生物是促进构成表达构建体/载体的核酸序列甲基化的微生物，优选地限化构建体/载体上的甲基转移酶基因就会被诱导。诱导可以通过任何合适的启动子系统进[0136]在特定实施例中，甲基化构建体/载体具有对穿梭微生物的身份有特异性的复制建体/载体上存在的核酸序列能够掺入到目的微生物中并微生物中分离一种或多种构建体/载体，并且然后将表达构建体/载体进入到目的微生物[0141]设想了如以上定义的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体可以组合以提供物[0143]本领域的普通技术人员将理解用于产生本公开的微生物的许多合适的甲基转移[0144]可以使用任何数量的适于允许甲基转移酶基因表达的构建体/载体以产生甲基化30mol％的H2。在一些实施例中，气态底物可以包含相对较高量的H2，如约60、70、80或[0151]气态底物和/或C1碳源可以是作为工业过程的副产物或从一些其它来源获得的废放到大气中之前使用任何适宜方法从工业工艺中采作所公开的气体发酵过程的原料并且可以由各种固[0156]底物和/或C1碳源可以是作为工业过程的副产物获得的废气或来自另一种来源的[0159]底物和/或C1碳源可以是包含甲烷的气流。这种含甲烷的气体可以从化石甲烷排计算或可持续碳与总产物的质量平衡)到生物反应器中，以维持对提供给培养物的碳的跟(WO2013/180581)、包括异戊二烯在内的萜烯(WO2013/180584)、脂肪酸(WO2013/191567)、2丁醇(WO2013/185123)、1,2丙二醇(WO2014/036152)、1丙醇(WO2017/丁酸盐或2羟基异丁酸(WO2017/066498)、异丁烯(WO2017/066498)、己二酸(WO2017/过所属领域中已知的任何方法或方法的组合进一步加工微生物生物质以生产单细胞蛋白公开的微生物可以被工程化以便以特定选择率或最小选择率产生产物。在一个实施例中，占由本公开的微生物产生的全部发酵产物的至少30使得本公开的微生物的乙烯的选择质的至少一部分可以被转化成单细胞蛋白(可以包含将微生物生物质与一种或多种赋形剂[0175]培养通常在含有足以允许微生物生长的营养素、维生素和/或矿物质的水性培养[0179]可以使用任何方法或技术领域中已知的方法的组合从发酵培养液中分离或纯化多种目标产物。醇和/或丙酮可以例如通过蒸馏回收。可以例如通过吸附于活性炭来回收[0180]在一些实施例中，可以使用本领域已知的任何合适的分离和/或纯化技术分离和[0183]在一个实施例中，气体发酵产物可以使用反渗透和/或渗透蒸发从发酵液中浓缩种方法中，气体发酵产物可以从水性溶液中捕集在活性炭上从稀水溶液中回收乙二醇、糖和相关的多OH化合物(RecoveryofGlycols,Sugars,andRelatedMultiple_OHCompoundsfromDilute_AqueousSolutionbyRegenerableAdsorptionontoActivatedCarbons)”,加利福尼亚大学伯克利分校(Universityof[0184]已证明有多种从含水介质中回收二醇的方法。已使用模拟移动床(SMB)技术从乙醇和相关含氧化合物的含水混合物中回收2,3_丁二醇(美国专利8,658.845)。反应性分离[0207]低密度聚乙烯(LDPE)和线性低密度聚乙烯(LLDPE)主要用于膜应用，如食品和非[0210]由此产生的环氧乙烷是包括单乙二醇制造在内的许多重要商业工艺中的关键化2019/126400(其公开内容通过引用整体并入本文能够将2磷酸D甘油酸盐转化为3磷酸D甘油酸盐的酶；能够将3磷酸D甘油酸盐转能够将3磷酸L丝氨酸转化为丝氨酸的酶；能够将丝氨酸转化为甘氨酸的酶；能够将5,为乙醛酸盐的异源酶是丙氨酸一乙醛酸转氨酶[2.6.1.44]、丝氨酸一乙醛酸转氨酶够将乙醇酸盐转化为乙醇醛盐的异源酶是乙醇醛脱氢酶[1.2.1.21]、乳酸醛脱氢酶[0214]根据所描述的方法中的任一种方法所产生的单乙二醇可[0223]根据单乙二醇的酯交换或酯化产生的聚对苯二甲酸乙二醇酯对于许多包装应用[0225]本公开提供了包含由微生物并且根据本文所描述的方法产生的乙二醇的组合[0226]本公开还提供了包含由微生物并且根据本文所描述的方法产生的乙二醇的聚合Rev.)》,116(4):2170_2243(2016)和Xiao等人,《工业与工程化学研究(IndEngChem中，包括消毒擦手剂(WO2014/100851)、对亚甲基二醇和甲醇中毒的治疗处理(WO2006/国专利第3,102,875号)、大麻溶剂(WO2015/073854)、作为防冻提取溶剂(WO2017/[0230]在另外的实施例中，根据所述方法产生的异丙醇或异丙基醇(IPA)可以用于许多电子部件和金属制造中用作清洁剂和干燥剂，以及在医疗和兽医产品中用作气溶胶溶剂。PLGA、PLGA_PEG_PLGA和其共聚物和混合物)、纤维素和纤维素衍生物(例如，羟丙基纤维[0242]根据实施例所述的方法，其中所述气态底物源自产品循环工艺或可持续化学工至少一种第一产物和所述至少一种第二产物[0257]用于由气态底物循环产生轮胎的一个实施例涉及第一气体发酵工艺和第二气体少一种第二产物，其中所述至少一种第一产物和所述至少一种第二产物共聚以形成聚合将气态底物传递到含有能够在培养基中产生选自乙烯和烯烃或其任何组合的至少一种第物转化为所述至少一种第二产物；并且从所述生物反应器中回收所述至少一种第二产物；个串联重复序列的至少一种蛋白质的异源核酸和编码至少一种分泌的化学产物的异源核重复序列的至少一种异源蛋白的异源核酸和编码至少一种化微生物能够在细胞中累积所述至少一种异源蛋白并且从所述细胞中分泌所述至少一种化异源功能蛋白和具有至少两个或更多个碳的至少一种化学产物的经基因工程化的C1固定异源功能蛋白和具有至少两个或更多个碳的至少一种化学产物的经基因工程化的C1固定[0283]根据实施例所述的微生物，其中所述微生物包含经基因工程化的C1固定型微生在细胞中累积所述至少一种异源蛋白并且从所述细胞中分泌所述至2和H2中的一种或多种的气态底物的情况下培养所述经基底物的情况下培养根据权利要求1所述的经基因工程化微生物，其中所述培养是连续发酵[0291]根据实施例所述的微生物，其中所述微生物包含经基因工程化的C1固定型微生[0292]根据实施例所述的微生物，其中所述微生物是选自[0317]合成编码串联重复蛋白的基因(表2)，并且组装到梭菌_大肠杆菌穿梭载体有预克隆的梭菌启动子和终止子。启动子序列描述于Karim等人《合成生物学(Synthetic[0319]使用抗Strep标签抗体通过蛋白质印迹分析评估串联重复蛋白的产生。将培养物[0325]含串联重复蛋白的菌株SRT008和SRT012(表2)在CSTR中在分批模式下表征，以表4B)，并且达到了1537毫摩尔/升/天的峰值CO摄取。除了9.57g/L的峰值乙醇浓度(图4A、CO2和10％N2)、3L反应器和细胞再循环膜(CRM)，在第5天开始1.2个容器/天(vD。生物质浓度累积到20.85gDCW/L的峰值浓度(图2B)，并且CO气体摄取达到9300毫摩[0330]在所有分析的样品中都观察到SRT008蛋白(图2A)。使用抗Strep标签抗体通过蛋染色以显示总蛋白，并且然后用与辣根过氧化物酶缀合的抗Strep标签抗体探测以显示特[0332]含串联重复蛋白的菌株SRT008和SRT012(表2)在CSTR中在分批模式下表征，以表[0336]编码乙烯形成酶的基因是密码子适应的，并且被合成用于在钩虫贪铜菌中表序列确认的质粒转化到钩虫贪铜菌PHB_4中，并且在含有50mg/L氯霉素的胰蛋白酶大豆发L氯霉素的TSB板上划线并在30℃下温育72小时进行菌株复活。[0337]来自新鲜划线的TSB板的单菌落被用于接种在14mLFalcon圆底聚苯乙烯试管中的含50mg/L氯霉素的3mLTSB，所述试管带有弹扣盖。在ThermoMAXQ摇床中在30℃和[0338]使用100mL上述培养物来接种含有600mL2x启动培养基的1.4_LInforsHTO2、41％H2、3％CO2、52.86％N2)启动。随着培养物生长，搅拌和气流量逐渐增加到[0339]来自反应器的气体样品通过305不锈钢连接到由微GC控制的流选择阀(制造商：Qmicro)。然后通过热导检测器(TCD)在等温条件下(70℃)在Rt_UBONDXPPLOT柱上分析其程度如同每篇参考文献被单独并且具体地指出通过引用并入并且在本文中被整体阐述。