CN119452252A 用于癌症诊断和治疗预后的免疫组分析方法和系统 （克里斯南·闻卡塔克里斯南）

2024.12.10PCT/CA2023/0505012023.04.12WO2023/197076EN2023.10.19用于癌症诊断和治疗预后的免疫组分析方本发明提供了一种为受试者提供癌症评估中至少一种肿瘤相关免疫细胞(TAIC)或TAIC衍个参考图谱进行比较；(iii)其中所述测试图谱与一个或多个参考图谱的相似性或差异指示一2a.测量从受试者获得的液体样本中至少一种肿瘤相关免疫细胞(TAIC)或TAIC衍生的c.其中所述测试图谱与所述一个或多个参考图谱的相似性或差异指示一个或多个癌4.根据权利要求1_3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种TAIC衍生的生物标志5.根据权利要求1_3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种TAIC衍生的生物标志物包含来自至少一种肿瘤相关免疫细胞的一6.权利要求1_3中任一项所述的方法，其中所述一种或多种TAIC衍生的生物标志物包9.根据权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种TAIC衍生的生物标志物包含所述11.根据权利要求1_10中任一项所述的方法，其中所述一个或多个癌症性状通过拉曼12.根据权利要求1_3中任一项所述的方法，其中所述一个或多个癌症性状通过DNA下13.根据权利要求1_12中任一项所述的方法，其中所述参考图谱源自一个或多个参考3肿瘤相关免疫细胞(TAIC)或TAICb.将所述一定体积的液体的至少一部分添加到纳米法期间放大由所述至少一种TAIC或TAIC衍生的生物标志物发射样本拉曼光谱具有放大信号，所述放大信号指示所述纳米传感器上存在至少一种TAIC或29.根据权利要求28所述的方法，其中基于确定哪些相关值大于相关阈值来检测所述4所述癌症特征的已知癌症样本的模板拉曼光谱进行30.根据权利要求28所述的方法，其中所述样本的一个或多个癌症特征通过以下方式(ii)通过将所述特征值应用于针对至少一种TAIC或TAIC衍生的生物标志物确定的至32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述分类模型包含：偏最小二乘判别分析34.根据权利要求28_33中任一项所述的35.根据权利要求28_34中任一项所述的方法，36.根据权利要求28_34中任一项所述的方法，39.根据权利要求37所述的方法，其中所述一种或多种TAIC衍生的生物标志物包含无40.根据权利要求28_34中任一项所述的方法，其中所述一种43.根据权利要求28_42中任一项所述的方法，其中提45.根据权利要求28_44中任一项所述的方法，其中所述癌症5(i)对所述样本拉曼光谱进行进一步的数据处理，以将所述第二放大信号与所述第二模板拉曼光谱进行比较，以确定所述样本拉曼光谱与所述第二模板拉曼光谱之间的相关48.一种生成用于癌症评估的参考肿瘤相关免疫细胞(TAIC)的方法，所述方法包括将一种或多种初始免疫细胞与肿瘤和/或癌细胞系共培养，直到一种或多种参考肿瘤相关免6[0002]本申请要求于2022年4月12日提交的美国临时申请US63/330,123的优先权，该申[0006]早期检测和监测复发已被证明具有降低癌症死亡率的潜非侵入性癌症诊断研究依赖于循环无细胞DNA、循环肿瘤细胞和外泌体等内源性生物标志[0010]测量从受试者获得的液体样本中至少一种肿瘤相关免疫细胞(TAIC)或TAIC衍生[0012]其中所述测试图谱与所述一个或多个参考图谱的相似性或差异指示一个或多个7[0021]在另一个实施方案中，一种或多种TAIC衍生的生物标志物包含无细胞DNA的结构8存在。的一定体积的液体进行拉曼光谱法以产生样本拉曼光谱，所述样本拉曼光谱具有放大信本光谱数据进行特征提取以提取特征值；通过将所述特征值应用于针对至少一种TAIC或TAIC衍生的生物标志物确定的至少一组分类模型来进行分类，以检测一个或多个癌症特9初始免疫细胞与肿瘤和/或癌细胞系共培养，直到一种或多种参考肿瘤相关免疫细胞[0052]从下面结合附图的详细描述中，本申请的这些和其他特征和优点将变得显而易症特异性特征的工作流程，以及(b)使用公开的方法在临床环境中进行癌症诊断的潜在工[0056]图3显示了发现对癌症存在具有特异性的独特T细胞特征，a)展示肿瘤相关T细胞胞与非癌症相比表现出明显的表型差异的小提琴图。c)显示早期癌症中的T细胞与晚期癌症相比表现出明显的表型差异的tSNE图，d)展示了明显的差异是由PC1中表示的峰造成的诊断为早期癌症的概率的散点图，f)显示使用肿瘤相关T细胞特征诊断早期癌症的机器学特征进行癌症分期的机器学习模型的性能的校准曲线，灵敏度为98.4特异性为100％。[0059]图6显示了使用循环自然杀伤细胞分析(CNKP)和肿瘤免疫探针平台进行癌症诊断的方法示意图。SERS训练数据来自体外产生的癌细胞相关NK细胞和癌症干细胞(CSC)相关[0060]图7显示了发现对癌症存在具有特异性的独特NK细胞特征，a)展示肿瘤相关NK细[0061]图8显示了独特的肿瘤相关NK细胞特征在癌症诊断和早期癌症诊断中的应用。a)[0062]图9显示了独特的肿瘤相关NK细胞特征在癌症分期和癌症转移诊断中的应用。a)关NK细胞特征进行癌症分期的机器学习模型的性能的校准曲线，灵敏度和特异性均为[0064]图11显示了独特的肿瘤相关巨噬细胞特征在癌症诊断和早期癌症诊断中的应瘤相关巨噬细胞特征诊断癌症的机器学习模型的性能的校准曲线，灵敏度和特异性均为噬细胞特征诊断早期癌症的机器学习模型的性能的校准曲线，灵敏度为98.5特异性为[0065]图12显示了独特的肿瘤相关巨噬细胞特征在癌症分期和癌症转移诊断中的应现出明显的表型差异。d)展示了明显的差异是由PC1中表示的峰造成的树状图(左)和热图[0067]图14显示了独特的肿瘤相关树突状细胞特征在癌症诊断和早期癌症诊断中的应胞特征诊断早期癌症的机器学习模型的性能的校准曲线，灵敏度为97.1特异性为胞和非肿瘤B细胞的B细胞表型差异的tSNE图，b)早期癌症中的B细胞与非癌症相比表现出[0069]图16显示了独特的肿瘤相关B细胞特征在癌症诊断和早期癌症诊断中的应用。a)本诊断为早期癌症的概率的散点图，f)显示使用肿瘤相关B细胞特征诊断早期癌症的机器癌中的多种癌症早期诊断和肿瘤组织来源确定中的应用，a)肿瘤相关T细胞用于多种癌症多种癌症早期诊断的准确性接近100％。f)使用肿瘤相关免疫细胞进行多种癌症早期诊断的特异性接近100％。g)使用肿瘤相关免疫细胞进行多种癌症早期诊断的灵敏度接近关免疫细胞特征诊断癌症的机器学习模型的性能的校准曲线，灵敏度为100特异性为[0073]图20显示了卵巢癌(OC)的肿瘤微环境(TME)中中性粒细胞相互作用的示意图。顶[0075]图22显示了发现对卵巢癌存在有特异性的独特中性粒细胞特征。A显示了纳米传感器上未相互作用(i)和相互作用(ii)的中性粒细胞的示意图。B显示未相互作用(i)和肿显示了中性粒细胞通过氧化和非氧化机制发挥作用的示意图。D显示未相互作用和与卵巢[0076]图23显示了与卵巢癌细胞互相作用和与卵巢癌干细胞相互作用的中性粒细胞随时间的变化。A显示了具有卵巢癌和卵巢癌干细胞和中性粒细胞的异质性卵巢癌肿瘤微环[0077]图24显示了程序性死亡配体1(PD_L1)的拉曼特征，以及早期和晚期中性粒细胞[0080]图27显示了T细胞DNA作为乳腺癌早期检测的生物标志物的体外验证。(a)实验设计示意图(左)和从健康T细胞和与乳腺癌干细胞的无细胞DNA和肿瘤DNA之间的相似性，证实了将免疫细胞相关无细胞DNA应用于癌症诊断个细胞(ii)100万个细胞(iii)10,000个细胞(iv)1000个细胞进行培养。(b)从与不同大小的乳腺癌肿瘤类器官相互作用的T细胞中分离的DNA的SERS特征。(c)光学显微镜图像显示样本诊断为早期癌症(与健康相比)的概率的散点图诊断为晚期癌症(与早期相比)的概率的散点图，(i)显癌症预测的ROC曲线，(k)使用T细胞相关无细胞DNA特征，进行癌细胞分化诊断的示意图。(i)展示基于T细胞相关无细胞DNA特征的散点图，样本来自低分化、中分化率，(m)显示使用T细胞相关无细胞DNA特征诊断癌症分化状态的机器学习模型的性能的校症相比对乳腺癌相关的免疫基因组特征进行区分的散点图。d)显示最大方差的主成分(即乳腺癌中与DNA相关的特征峰的归一化强度的箱线图。d)展示与HER2阳性乳腺癌和HER2阴性乳腺癌相关的归一化峰强度之间的线性相关性的相关矩阵。e)多维尺度分析，以评估HER2阳性乳腺癌和HER2阴性乳腺癌的免疫基因组特征之间的相示了基于免疫基因组特征的HER2阳性原发性乳腺癌和HER2阳性转移性乳腺癌之间的差异来自转移性乳腺癌组织活检和HER2阳性转移性乳腺癌图谱的DNA的相似性的层次聚类(左)乳腺癌图谱的DNA的差异的层次聚类(左)和小提琴图(特征进行线性回归分析以确定细胞类型，e)每个百分比的免疫细胞DNA的估计和实际细胞[0089]图36显示转移性免疫基因组特征可以准确预测乳腺癌的转移以及转移是否为颅表型，e)独立的临床样本群组中转移性表型的模型预测，f)使用分类算法的特异性(97.2％)和灵敏度(100％)评估的机器学习模型的性能，g)展示对精确分类转移表型有贡显示了使用传感器生成拉曼光谱的实验设计示意图。B显示未相互作用(底部)和肿瘤相互作用(顶部)的NK细胞DNA的拉曼光谱。C显示使用[0091]图38显示NK细胞DNA甲基化特征可以区分与结直肠肿瘤相互作用的表型和未相互随着甲基化百分比的增加，峰强度也会上升。D显示了比色和拉曼计算结果，用于比较与结直肠癌相互作用的NK细胞DNA和健康NK细胞DNA中甲基化峰的比较。F显示具有甲基化特异性峰的主成分分析。G显示结直肠癌患者和健康患者的NK细胞甲基化特异性峰的拉曼[0092]图39显示NK细胞甲基化特征可以区分结直肠癌患者和健康志愿者。A显示结直肠癌患者血液(血沉棕黄层)的拉曼光谱(n＝7)。[0093]图40显示了具有DNA结构和甲基化峰的细胞培养物的增强数据的探索性分析，其中细胞培养物产生体外与结直肠肿瘤相互作用的NK细胞和与肿瘤不相互作用的NK细胞。(A)PCA显示未相互作用的DNA聚类和与肿瘤相互作用的DNA聚类明显分离。(于分类的结肠直肠癌特征为765cm_1、924cm_1、1011cm_1、1123cm_1、1310cm_1、1555cm_1、[0094]图41显示了通过GBM相关NK细胞衍生的细胞外囊泡和监督机器学习分类器检测胶析)对训练数据集进行降维，然后应用PLSDA(偏最小二乘判别分析)和ANN(人工神经网络)算法。右图显示了用于癌症检测的穿过血脑屏障(BBB)的循环免疫囊泡(CIV)生物标志物。使用的突出显示的NK细胞浸润胶质母细胞瘤肿瘤的免疫细胞相对数量，(iii)胶质母细胞瘤患者中免疫细胞的相对基因表达，(iv)显示174个胶质母细胞瘤样本中的免疫细胞基因胞外囊泡与免疫分析平台相互作用的示意图，(b)单个免疫细胞细胞外囊泡的SERS光谱，PCA可将自然杀伤细胞EV与免疫细胞EV混合物区分开来。(C)NK细胞与其EV之间的相似性。酸(中)和葡萄糖(右)的差异的条形图，以及它们相应的回归图(葡萄糖丙酮酸的R2=(H)和(I)分别显示未相互作用的免疫细胞囊泡和GBM相关免疫细胞囊泡之间中，酰胺III(1235cm_1)和蛋白质的Ch2变形(1447cm_1)增加(****＝P<0.0001，***＝P<[0097]图44显示了GBM相关和不相关NK细胞EV中的PDL_1和CTLA_4标志物比较。(A)PDL1和(E)分别显示关于PDL1和CTLA_4显示GBM相关免疫囊泡和非相互作用免疫囊泡中的PDL1(i)和CTLA_4(ii)表达。****＝P<定NK细胞衍生的细胞外囊泡中的GBM特征，以及未相互作用的NK细胞衍生的细胞外囊泡中SERS光谱被用作癌症数据集的输入训练数据，并且未相互作用的NK_92细胞衍生的EV(底部)的SERS光谱被用作健康对照。使用来自用GBM患者(v)和健康对照者(vi)血清样本的得分的变量的VIP得分绘制在x轴上，相应的变量绘制在y轴上。(D)人工神经网络(ANN)分胞瘤与GBM的分类标志物。(F)三种不同脑癌类型的光谱标志物比较。(G)层次聚类分析显[0100]图47显示了使用与卵巢癌相关的T细胞细胞外囊泡(EV)来诊断卵巢癌。左上方显了使用接收者操作特征曲线(ROC)分析对将样本分类为健康或卵巢癌的模型性能的评估。[0101]图48显示与脑肿瘤相关的T细胞特征可以预测早期和晚期癌症诊断。左图显示与癌相关的T细胞(顶部聚类)的树状图中存在[0103]图50A是显示根据本文所述的至少一个示例实施方案的癌症检测方法的步骤的框[0105]图50C是可与图50B的硬件配置一起使用的计算设备和软件的示例实施方案的框[0106]图50D是根据本文所述的至少一个示例实施方案，使用从患者样本获得的拉曼光谱对患者样本进行癌症评估的方法的流程图，所述方法可以通过图50C的计算设备的软件存储器元件和至少一个非易失性存储器元件)的一个或多个可编程设备上执行。硬件可以[0118]还应当注意，可能存在用于实现的本文所述实施方案的保护的主题可以存在于本文件任何部分(包含其权利要求和附图)所公开的元件或方法步对在人类生理(例如血液)样本中鉴定新的生物标志物以进行早期癌症检测和预测的兴趣[0124]测量从受试者获得的液体样本中至少一种肿瘤相关免疫细胞(TAIC)或TAIC衍生[0126]其中测试图谱与一个或多个参考图谱的相似性或差异指示一[0129]测量从受试者获得的液体样本中至少一种肿瘤相关免疫细胞(TAIC)或TAIC衍生[0143]参考图谱可以是参考值和/或可以来自一个或多个样本，任选地来自已知患有或数据可以是随着进一步收集样本和确定受试者是否患有癌症，或是否具有癌症的特定类图谱与非癌症特异性参考图谱的相似度低；和/或(ii)与非癌症特异性参考的相似度低于参考图谱之间的聚类更紧密来指示的，如通过例如由测试图谱和非癌症特异性参考图谱之间的聚类相比测试图谱和癌症特异性参考图谱之[0164]本申请还提供了一种生成用于癌症评估的参考肿瘤相关免疫细所述方法包括将一种或多种初始免疫细胞与肿瘤和/或癌细胞系共培养，直到一种或多种参考肿瘤相关免疫细胞(TAIC)表达一个或多个无细胞血浆)滴到第一纳米传感器上，以检测细胞成分生物标志物。在至少一个实施方案中，一定体积的血浆包含至少一种肿瘤相关免疫细胞(TAIC)或一种肿瘤相关免疫细胞[0170]本文用于生物分子检测的表面增强拉曼散射的纳米传感器包括一种或多种纳米棕黄层的体积包含一种或多种TAIC或TAIC衍生[0185]在步骤107中，通过拉曼光谱系统生成纳米传感器上一定体积的无细胞血浆的一[0186]在步骤108中，通过拉曼光谱系统生成纳米传感器上一定体积的血沉棕黄层的一[0187]图50B提供了用于在方法100的步骤107和/或108中，获得纳米传感器上样本的拉已放置在纳米传感器上的样本217(如血浆或血沉棕黄层样本)进行瑞利成像和分析。具体地，计算设备202通过I/O硬件(可能包含模拟数字转换器和/或USB电缆)连接到激光器204散射的光子(称为拉曼信号)随后在到达CCD相机230之前由返回路径中的光学元件聚焦和者包括这些硬件组件的预封装拉曼显微镜。计算设备202还可以包括电源单元(未示出)或[0195]数据存储器252包括易失性和非易失性存储器元件，例如但不限于：一个或多个[0196]数据存储器252还可以包括用于根据本文的教导实现拉曼成像、模型训练和癌症[0197]输入/输出模块252a可以包括用于接收获取的拉曼图像数据和用户控制数据的程[0199]拉曼成像模块252b用于当患者样本217位于可移动台216上时，控制激光器204产[0200]训练模块252d包括使用训练数据来确定癌症评估模块252b所使用的模型(例如分组合。可能需要模拟数字转换器256将输入/输出接口258接收的任何模拟数据转换为数字[0202]返回图50A，在步骤110中，计算设备202(即其处理器)执行处理，以分析从步骤析，包括将获得的拉曼光谱的拉曼带的特征峰与模板拉曼光谱的拉曼带的特征峰进行比_1处的峰归属于DNA/RNA碱基的环呼吸模式，1445cm_1C[0205]在至少一个实施方案中，相关性分析可以包括使用一个或多个相关性分析工[0207]在至少一个实施方案中，如果样本拉曼光谱与模板拉曼光谱之间存在高度相似本)与模板拉曼光谱的相关性分析显示相关性为65％或以上，则可以根据模板拉曼光谱的[0209]现在参考图50D，其中示出了使用从受试者样本获得的拉曼光谱对受试者样本进行癌症评估的方法300的流程图，所述方法可以通过根据本文所述的至少一个示例实施方虽然图50D显示了四种分类器的应用，但一些分类器可能并未基于用于执行分类的潜在生分。第一主成分可以定义为最大化方差的方向。第i个成分与最大化方差的第一主成分正[0212]或者，在操作306中，多元曲线分辨率分析(MCR)可用于对纯成分与混合测量(例于确定步骤308_314中使用的每个分类器的最佳分类模型。每个分类模型参数都可以存储准确性可能根据用于检测给定癌症特征的特定生物标志物而改变。在至少一个实施方案行训练以获得可由计算设备202的软件在从患者样本检测一个或多个癌症特征时使用的模类概率的分类器来确定拉曼光谱的癌症类型。可以去除与这种癌症类型相关的拉曼光谱，T细胞的数量最多。Zhao,W等人(2021)对来自胶质母细胞瘤患者活检的8397个细胞进行单(CGC)、OncoKB、癌症基因网络(NCG)、TSGene、IntOGene以及VolkanOkurandWendy[0236]T细胞在调节癌症微环境中发挥着至关重要的作用1。癌症和非癌症状态下的T细CD8T细胞的高丰度(SavasPetal.,2016)与患者的高并进一步显示肿瘤相关免疫图谱在性别之间表现出显著重叠(b)，并且不会随年龄而变化[0239]图3的a)中观察到的t分布随机邻域嵌入(tSNE)分析显示了癌症和非癌症之间T细显示，癌症相关T细胞和非癌症相关T细胞之间的大部分差异，是使用表1中峰位置对应的[0240]表1.对应于对癌症相关T细胞和非癌症相676.22854.81953.121129.61339.51419.8学习模型的性能，使用了灵敏度和特异性之间的权衡，即所谓的接收者操作特性(ROC)曲[0243]接下来，使用独特的肿瘤相关T细胞特征来评估该特征对于早期癌症诊断的适用肿瘤特异性T细胞群的精确表型和功能是肿瘤免疫学的中心目标，对于早期和转移性癌症特征可以准确分类转移，并能区分转移性样本和原发性样本，灵敏度为96.2特异性为[0254]此项研究是根据瑞尔森(Ryerson)大学瑞尔森伦理委员会(REB2020_275)进行[0256]原代NK细胞(干细胞技术)和NK_92细胞系(源自非霍奇金淋巴瘤)获自美美国模式(H69AR)和结肠腺癌(colo205)的癌细胞系。乳腺癌细胞系用含有10％FBS的DMEM维肺癌和结肠癌细胞系在含有10％FBS的RPMI16焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中。RNA浓度和比例通过光度法(Nanodrop)测定。通过RT_qPCR评估BCL_2的表达水平。RT_qPCR反应在96孔板上进行(带条形码的MicroAmpFast于管家基因GAPDH的倍数变化来表示。使用PrismGraphpad(v.9)进行统计分析(单向方差[0262]将5μl血沉棕黄层(血液)和10μl培养的NK_92细胞滴在肿瘤免疫探针平台上。1分[0266]这项研究表明，自然杀伤(NK)细胞的分子探测有为癌症患者提供诊断信息的潜[0267]在本研究中，采用近年来发展迅速的人工智能子领域机器学习(ML)进行诊断预肿瘤相关NK细胞的拉曼特征显示出碳水化合物、蛋白质和脂质的特征带。明显的峰是胞毒性和细胞表面激活。其他光谱峰源自细胞质内致密颗粒中的酶(ShenY,etal.,SERS的分子指纹在亚细胞水平将以非破坏性的方式提供实时信息(López_SotoA,etal.,[0273]然后比较了CSC相关的NK细胞。NK_CSC代谢物的主要变化包括二硫键延伸蛋白显胞最明显的带可见于1522cm_1处和1158cm_1处，属于类胡萝卜素(El_SaidWA,etal.,光谱显示了所述细胞的免疫细胞刺激/抑制的状态。已经鉴定出几种指示淋巴细胞激活的NK细胞在其表面表现出杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，其参与NK细胞的驯化[0274]这些肿瘤相关NK细胞和非癌症NK细胞之间的独特差异被用于癌症诊断，如图8所[0276]图8，e)显示了展示使用肿瘤相关NK细胞特征将样本分类为早期癌症的概率的散[0277]图9，a)显示了展示使用肿瘤相关NK细胞特征根据癌症分期对样本进行分类的概转移的准确分类，并且可以100％的灵敏度和特异性区分原发性样本和转移性样本(图9，相关巨噬细胞(TAM)在肿瘤发展、新血管生成调节、免疫抑制和转移中起着至关重要的作用16[0289]巨噬细胞可能用于检测癌症转移。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境的细胞[0292]图13，a)中观察到的tSNE分析显示了癌症和非癌症之间[0295]对这些肿瘤相关树突状细胞和非癌症树突状细胞之间的独特差异用于癌症诊断中DC的表型是异质性的，并且已鉴定出可驱动特定类型免疫反应的不同树突状细胞亚的热图显示，癌症相关B细胞和非癌症相关B细胞之间的大部分差异是由表4中所示的峰位677.94850.411083.41722.4[0303]将这些肿瘤相关B细胞和非癌症B细胞之间的独特差异用于癌症诊断，如图16所[0304]接下来，使用独特的肿瘤相关B细胞特征来评估该特征对于早期癌症诊断的适用[0305]图16，e)显示了展示使用肿瘤相关B细胞特征将样本分类为早期癌症的概率的散原发性不明(CUP)来源的癌症约占所有癌症诊断的3鉴定这些肿瘤的来源组织特别具有确定癌症的来源组织对于确定最合适的治疗方法和改善患98.999.7肺99.798.399.797.398.895.795.8肾97.999.299.297.999.299.298.997.190.596.298.398.3鼻98.998.999.398.597.8在RPMI1640+2mM谷氨酰胺+10_20％胎牛血清(FBS)中培养。从ATCC获取乳腺癌(MDA_MB231)、非小细胞肺癌(H69AR)和结肠腺癌(colo205)的癌细胞系。乳腺癌细胞系用含有癌症临床前模型相关的中性粒细胞获得了拉曼[0328]这项研究表明，与卵巢癌和卵巢癌干细胞相互作用的卵巢肿瘤相关中性粒细胞从患者血液的拉曼数据中获取肿瘤相互作用信号。通过使用人工神经网络(ANN)将光谱分胞系)被分化为中性粒细胞。这些中性粒细胞与OVCAR(来自ATCC的卵巢癌细胞系)共培养，强拉曼光谱法(SERS)分析对照和TAN中存在的代谢表型。SERS是一种广泛用于分析生物样拉曼光谱的主要贡献者来自细胞生物大分子，如672cm_1对应于胱氨酸和胞嘧啶的C_S拉伸到，TAN的特征是脂质贡献减少和核酸贡献增加。使用层次聚类分析也获得了类似的结果了与癌症和CSC相关的中性粒细胞中与蛋白质相关的代谢变化(分别为图23中的D和E)。观在6小时和24小时的时候可见蛋白质含量两次显著清晰的聚类，表明中性粒细胞根据相互作用的细胞及其相互作用的持续时间获得异质表[0335]在本研究中，免疫检查点蛋白程序性死亡配体_1(PD_L1)被用作癌症相互作用的1463cm_1利用中性粒细胞作为生物标志物并采用基于机器学习的诊断模型，可以实现OC的早期检癌干细胞相互作用的T细胞的DNA中的集体分子变化，为个体疾病状态提供了重要的信息。的肿瘤相关信号。为了验证使用液体活检反映肿瘤信号的可行性，研究了患者肿瘤DNA、BCSCATDNA和匹配的患者血浆(即无细胞DNA)之间存在的信号的相似性。从患者肿瘤样本明血浆中的无细胞DNA是癌症诊断中有用的生[0349]由于不同等级的T细胞表型和丰度有显著而明显的变化，因此使用原发性乳腺癌干细胞的异质细胞进行计数，并将其接种于Aggrewell板中，以形成已知尺寸的肿瘤类器不同大小的肿瘤培养物相互作用的T细胞中分离DNA。使用纳米传感器记录了DNA的SERS光DNA中未观察到这些峰，这清楚地表明T细胞在与肿瘤相互作用时会发生基因组水平的变细胞分化水平的能力。从图30可以观察到，用于乳腺癌早期诊断的基于免疫细胞DNA的方特异性为86.8％(图30，i)。类似地，可以检测早期乳腺癌的细胞分化水平，灵敏度为[0354]通过将初始T细胞与体外模型(MDA_MB_231、MDA_MB361)产生的富含乳腺癌干细来解释肿瘤样本中观察到的肿瘤异质性。从与乳腺癌干细胞球体共培养的T细胞中分离的以及算法能够降低噪声对聚类的影响，因此还应用鲁棒局部线性嵌入算法进行聚类分析。[0355]此外，PC载荷分析精确定位了导致乳腺癌免疫基因组特征差异的特定SERS峰(图反应79组特征是否不同。为此，分析了HER2阴性乳腺癌(MDA_MB_231)和HER2阳性乳腺癌(MDA_MB361)的体外模型产生的富含乳腺癌干细胞的球体与初始T细胞共培养的基因组特征(图32，87阳性原发性乳腺癌(BT474)和HER2阳性转移性乳腺癌(MDA_MB361)的体外模型产生的乳[0363]采用层次聚类算法来评估从组织活检样本中分离的DNA中转移性免疫基因组特征环肿瘤DNA的贡献仍未被广泛探索，因此它们作为液体活检生物标志物的适用性也尚不清转移105功能110最后，使用合成的混合物数据来训练算法，并使[0372]为了评估转移性免疫基因组特征的有效性，对来自诊断患有转移性乳腺癌(n=过血液样本预测肿瘤转移具有很高的准确性。此外，该分类的特异性和灵敏度分别为[0373]液体活检假阳性结果的临床影响是巨大的，因为它可能导致误诊或影响治疗方案113阴性转移性乳腺癌样本(图36)之间的特异性疫细胞(NK细胞)DNA和结直肠肿瘤相互作用NK细胞DNA的拉曼特征图谱，并获得785nm波长205)相互作用的体外自然杀伤细胞(NK_92)，和与健康的肿瘤未相互作用的自然杀伤细胞[0379]纳米传感器检测DNA分子变化的能力，允许进一步研究评估NK细胞甲基化变化的[0380]鉴于与结肠肿瘤发生相互作用的NK细胞(colo_205与NK_92共培养)的DNA分子变用了分子和甲基化标志物的集体拉曼光谱。PCA结果显示患者样本清晰地聚类为两个不同清楚地说明了两种样本类型之间的区别。[0381]利用DNA结构和甲基化峰，将基于主成分分析的探索性方法应用于体外与结直肠肿瘤相互作用的NK细胞DNA(CNKDNA)和与肿瘤未相互作用的NK细胞DNA(NKDNA)的拉曼光[0383]除了PLSDA之外，还使用了人工神经网络(ANN)来显示预测与所使用的算法无[0391]使用Renishawinvia共焦光谱仪和LeicaDMI6000落射荧光显微镜获取SERS光分析之前，原始数据经过SpectraGryph1.2预处理，以去除宇宙射线、平滑(Savitsky_分析(PCA)进行多变量分析。PCA通过获取样本中的所有特征来显示样本中的异常值(HotellingT2检验)和方差，成分得分图显示样本内的相关性。执行PLSDA来区分分类变[0394]本实施例表明，与胶质母细胞瘤肿瘤微环境(TME)相互作用的循环免疫细胞囊泡该模型对测试数据提供了100％的灵敏度和1通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)和电子显微镜进行表征。NTA通过数码相机测量较大囊泡(微囊泡)和较小囊泡(外泌体)的尺寸，该数码相机记质在EV周围聚集，较大的囊泡似乎具有花椰菜形态(ShibueTandWeinbergRA,2017))。[0398]将NK细胞(NKC)谱与CIV光谱进行比较，以确定CIV是否表现出与亲本NK细胞相似PCA是为了显示最大方差，但这里PCA用于显示光谱之间的相似性。选择前三个成分(PC1、PC2和PC3)以包括至少70％的方差。在具有3个成分的PCA得分图中，NKC和CIV样本紧密聚连接是CIV与前三个主成分的生化相似性，红色表示的连接(NK细胞)显示了与前三个主成[0402]与源自未相互作用的NK细胞的免疫囊泡相比，源自GBM相关NK细胞的免疫囊泡的状态显著影响其产生的EV的内容。从GBM_CIV获得的独特SERS光谱中可以明显看出这一点来自甘氨酸主链和脯氨酸侧链的酰胺III和CHCO对称拉伸酰胺I带(与N_H弯曲连接的CO拉伸)编程将GBMCIV与健康CIV区分开来，健康CIV维持由肿瘤部位营养缺乏引起的能量需求增低NK细胞的细胞毒功能(GuoS,etal.,2021)。此外，脂质含量的变化会影响信号转导途型的改变有关。使用SERS研究了GBMCIV和健康CIV中的脂质贡献。振动位于3015cm__1、著的变化是在1672cm_1处的酰胺I、在1235cm_1处的酰胺III果表明GBM_CIV的代谢特征可用作GBM诊为逃避检测的一种方式。由于NK细胞仅在与肿瘤相互作用时表达PDL_1，因此NK细胞中的例决定。优化后的PLS_DA模型正确预测了20个样本中的10个GBM和10个健康样本。从用于000[0422]实施例13_使用NK细胞胞外囊泡区分星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和胶质母细胞瘤[0424]图46C显示了使用前两个主成分的主成分分析，显示拉曼光谱能够清楚区分低级步鉴定表征低级别和高级别肿瘤的关键光谱数据点，从PCA的PC1和PC2载荷中获取了光谱_1的光谱数据点，对区分低级别星形细胞瘤和高级别GBM贡献最大[0426]获取了健康T细胞和与卵巢癌临床前模型相关的T细胞的细胞外囊泡(EV)的拉曼[0428]从与早期脑癌和晚期脑癌的临床前模型相关的T细胞，获得了拉曼光谱特征(图诱导可以识别和破坏附近的肿瘤细胞的免疫反应。T细胞通过识别特定的肿瘤相关抗原并吸引其他免疫细胞到肿瘤部位来对良性肿瘤作出反应。通过研究对良性脑肿瘤的T细胞的[0435]AmesE.etal.,“NKcellspreferentiallytargettumorcellswitha4019,2015.555,2018.ofIntracellularStateBasedonControlled3DNanostructuresMediatedSurfacejournal.pone.0015836.[0438]Gentles,A.J.etal.Theprogno[0439]GuoS.,PoppJ.,andBocklitzT.,“ChemometricanalysisinRamanspectroscopyfromexperimentaldesigntomachinelearning–basedmodeling,”Natureprotocols,vol.16,no.12,pp.5426–5459,2021.[0440]HimstedtR.etal.,“LocalizedsurfaceplasmonresonancesofvariousofMaterials,vol.29,no.17,pp.7371–7377,2017.[0441]Ichimura,T.etal.Non_labelimmunecellstatepredictionusingRaman[0442]JiangS.,MunkerR.,andAndreeffM.,“Bcl_2isexpressedinhumanpp.312–7,19971996.[0443]KornbergM.D.,“TheimmunologicWarburgeffect:Evidenceandtherapeuticopportunitiesinautoimmunity,”WileyInterdiscipRevSystBiolMed,vol.12,no.5,pp.e1486–e1486,Sep.2020,doi:10.1002/wsbm.1486.[0444]Kresovich,J.K.etal.“PrediagnosticImmuneCell[0445]López_SotoA.,GonzalezS.,SmythM.J.,andGalluzziL.,“ControlofKillerCellImmunotherapyTargetingCancerStemCells,”Expertopiniononbiologicaltherapy,vol.17,no.3,p.313,2017.10,pp.733–763,2021.[0448]Movasaghi,Z.,Rehman,S.&Rehman,I.U.Ramanspectroscopyofbiological[0450]PirzadehZ.,PakizehT.,MiljkovicV.,LanghammerC.,andDmitrievA.,pp.158–162,2014.S.S.Detectingcancersthroughtumor_activatableminicirclesthatleadtoa[0452]Salmon,H.&Donnadieu,E.Withintumors,interactionsbetweenTcellsandtumorcellsareimpededbytheextracellularmatrix.Oncoimmunology1,992[0453]Savas,P.etal.ClinicalrelevanceofhostimmunityinbreastcafromTILstotheclinic.Nat.Rev.Clin.ORamanspectroscopyforsubcellularcomno.10,pp.4872–4893,2021,doi:10.7150/thno.56409.[0456]ShibueT.andWeinbergR.A.,“EMT,CSCs,anddrugresistance:thevol.14,no.10,pp.611–629,2017.[0457]TallericoR.etal.,“HumanNKcellsselectivetargetingofcoloncancer–initiatingcells:arolefornaturalcytotoxicityreceptorsandMHCinlungadenocarcinomarevealsreproducibleprognosticassociationswithimplicationsforimmun[0459]Wellenstein,M.D.&deVisser,K.E.Cancer_Cell_IntrinsicMechanismsShapingtheTumorImmuneLaspectroscopy,”inEncyclopediaofSpectroscopyandSpectrometry,1287.[0461]XuY.etal.,“Killerimmunoglobulin_likereceptors/humanleukocyteantigenclass_I,acrucialimmunepathwayincancer,”Annalsoftranslationalmedicine,vol.8,no.5,2020.[0462]Zhao,W.etal.Deconvolutionofcelltype_specificdrugresponsesin[0464]1.Waldman,immunotherapy:fromTcellbasicsciencetoclinicalpractice.NatRevImmunol[0465]2.Ren,H.,Cao,K.&Wang,M.ACorrelationBetweenDifferentiationPhenotypesofInfusedTCellsandAnti_CancerImmunotherapy.Frontiersin[0467]4.Whitaker,K.Ea[0469]6.Wang,Q.etal.GeneticassociationsofTcerelatedgeneswithTcellphenotypesandclinicaloutcomesofearly_stage[0470]7.Guo,G.etal.Immunecellconcentrationsamongtheprimarytumormicroenvironmentincolorectalcancerpatientspredictedbyclinicopathologiccharacteristicsandbloodindexes.JournalforImmunoTherapyofCancer7,1–13[0472]14.Nakamura,K.&Smyth,M.J.ImmunoeditingofcancermetastasisbyNK[0473]15.Mantovani,A.,Allavena,P.,Marchesi,F.&Garlanda,C.Macrophagesas[0474]16.Cendrowicz,E.,Sas,Z.,BinCancerDevelopmentand[0475]17.Kumari,N.&Choi,S.H.Tumor_associatedmacrophagesincancer:recentadvancementsincancernanoimmunotherapies.JournalofExperimental&[0476]18.Poh,A.R.&Ernst,M.TargetingMacrophagesinCancer:FromBenchtosmallcelllungcancerandadvancementsin3Dco_cultures.eLife12,e82998cellmigration,invasion,andmetasta[0479]21.Conway,E.M.etal.Macrophages,inflammation,andlunJournalofRespiratory[0480]24.Duan,Z.&Luo,Y.Targetingmacrophagesincancerimmunotherapy.Sig[0481]25.Dendriticcellsincancerimmunologyandimmunotherapy|NatureReviewsImmunology./articles/s41577_019_0210_z.[0482]26.DelPrete,A.etal.FunctionalRoleofDendriticCellSubsetsinCancerProgressionandClinicalImplica[0483]27.Veglia,F.&Gabrilovich,D.I.Dendriticcellsincancer:theroleImmunology,andDistributioninVariousAnimalSpecies.IntJMolSci22,8044[0486]30.Wang,H.etal.Metaboliclabelingandtargetedmodulationofdendriticcells.NatureMaterials(2020)doi:10.1038/s41563_020_0680_1.[0487]31.Engelhard,V.etal.Bcellsandcancer.CancerCell39,1293–1296[0489]35.Hao,D.etal.TheSingle_CellImmunogenomicLandscapeofBandPlasmaCellsinEarly_StageLungAdenocarcinoma.CancerDiscovery12,2626–2645[0490]36.Wang,S.etal.Tumor_infiltratingBcells:theirroleandapplicationoftissueoforiginincarcinomaofunknownprimarywithamicroarray_basedoriginclassificationforcancerofunknownprimarydiagnosticsusinggenome_widemutationfeatures.NatCommun1[0493]39.Miao,Y.etal.Identifyingcancertissue_of_originbyanovelmachinelearningmethodbasedonexpressionquantitativetraitloci.Front[0495]41.Xia,D.etal.Minimalistapproachestocancertissue_of_originclassificationbyDNAmethylation.ModernPat[0496]42.Murata,M.Inflammationandcancer.EnvironmentalHealthandMatlung,H.L.Neutrophilsincancer.ImmunolRev273,[0498]44.Mishalian,I.,Granot,Z.&Fridlender,Z.G.Thediversityofcirculatingneutrophilsincancer.Immunobiolo[0499]45.Uribe_Querol,E.&Rosa[0500]46.Fridlender,Z.G.etal.PolarizationofTumor_AssociatedNeutrophilmetastasis.JHematolOncol[0502]48.Dissemond,J.etal.Activatedneutrophilsexertantitumoractivityagainsthumanmelanomacells:reactiveoxygenspecies_inducedmechanismsandtheirmodulationbygranulocyte_macrophage_colony_stimulatingfactor.JInvestDermatol121,936–938(2003).49.Wang,T.etal.Tumour_activatedneutrophilsingastriccancerfosterimmunesuppressionanddiseaseprogressionthroughGM_CSF_PD_L1pathway.Gut6[0503]50.Lei,X.etal.Immunecellswithinthetumormicroenvironment:Biologicalfunctionsandrolesincancerimmunotherapy.CancerLeImmunotherapy.FrontiersinCell[0505]52.Gentles,A.J.etal.Theprognosticlandscapeofgenesandinfiltratingimmunecellsacrosshumancancers.Naturemedicine21,938–945[0506]53.Kumar,S.&Dikshit,M.MetabolicInsightofNeutrophilsinHealt[0507]54.Li,Y.etal.Theregulatoryrolesofneutrophilsinadaptive[0508]55.Zhao,H.etal.Inflammationandtumorprogression:signalingpathwaysandtargetedintervention.SigTransductTarget[0509]56.Nicolás_J.Adrover,J.M.&Hidalgo,A.Neutrophilsinhomeostasis,immunity,andcancer.Immun[0510]57.Ramoji,A.etal.Towardaspectroscopichemogram:Ramanspectroscopicdifferentiationofthetwomostabundantleukocytesfrom[0511]58.Pully,V.,Lenferink,A.T.&Otto,C.Time_lapseRamanimagingofsinglelivelymphocytes.JournalofR[0512]59.Sijtsema,N.,Otto,C.,Segers_Nolten,G.M.,Verhoeven,A.&Greve,J.ResonanceRamanmicrospectroscopyofmyeloperoxidaseandcytochromeb558inhumanneutrophilicgranulocytes.BiophysicaljournalhumanlymphocytesubpopulationsandnaturalkillercellsbyRamanmicrospectroscopy.Cytometry:TheJournaloftheInternationalSocietyforAnalyticalCytology14imagingofheme_containingRamanmicroscopy.TheJournalofPhysicalChemistryB108,[0515]62.Baci,D.etal.TheOvarianCancerTumorImmuneMicroenvironment(TIME)asTargetforTherapy:AFocusonInnateImmunityCellsasTherapeutic[0516]63.Yajuk,O.etal.ThePD_L1/PD_1AxisBlocksNeutrophilCytotoxicity[0517]64.Zhang,S.etal.BerberineMaintainReverseCancerCellResistancetoDoxorubicin.FrontiersinPharmacology10,andBreastCancerCellsInduceCancerStemCell–likeProperties.Cancer[0519]66.Surface_EnhancedRamanSpectroscopyofDNA|JournaloftheAmerChemicalSociety./doi/10.1021/ja800023j.[0520]67.DeGelder,J.,DeGussem,K.,Vandenabeele,P.&Moens,L.ReferencedatabaseofRamanspectraofbiologicalmolecules.JournalofRaman[0521]68.Ghebeh,H.etal.FOXP3+TregsandB7_H1+/PD_1+Tlymphocytesco_infiltratethetumortissuesofhigh_riskbreastcancerpatients:Implicationidentificationofhigh_riskbreastcancerpatientsandthoseatriskoflaterelapse.JClinOncol[0523]70.Abo_Elenein,A.,Elgohary,S.E.&Hashish,A.SignificanceofImmunoregulatoryTCellsinDifferentStagesofBreastCancerPatients.8.[0524]71.LeongPP,MohammadR,IbrahimN,IthninH,Abdullah(2006).Phenotypingoflymphocytesexpressingregulatoryandeffectormarkersininfiltratingductalcarcinomaofthebreast.ImmnolLett.102:229–36._GoogleSearch.N％2C+Ithnin+H％2C+Abdullah+M％2C+Davis+WC％2C+Seow+HF(2006).+Phenotypinglymphocytes+expressing+regulatory+and+effector+markers+in+infiltrating+ductal+carcinoma+of+the+breast.+Immnol+Lett.+102％3A229％E2％80％9336.&rlz=1C1CHBF_enCA899CA899&oq＝Leong+PP％2C+Mohammad+R％2C+Ibrahim+N％2C+Ithnin+H%2C+Abdullah+M％2C+Davis+WC％2C+Seow+HF(2006).+Phenotyping+of+lymphocytes+expressing+regulatory+and+effector+markers+in+infiltrating+ductal+carcinoma+chrome69i57.284j0j7&sourceid＝chrome&ie＝UTF_8.surfaceenhancedRamanscatteringhotspotmatrix.ELECTROPHORESIS40,2104–2111[0526]73.Barhoumi,A.,Zhang,D.,Tam,F.&Halas,N.J.Surface_EnhancedRamanSpectroscopyofDNA.ACSPublications/doi/full/10.1021/ofImmuneInfiltrationinBreastCancerandTheirClinicalImplications:AGene_Expression_BasedRetrospectiveStudy.PLOSMedicine[0529]76.Wang,S.etal.Clinicalsignificanceandimmunogenomiclandscapeanalysesoftheimmunecellsignaturebasedprognosticmodelforpatientswbreastcancer.BriefBioinfo[0530]77.Movasaghi,Z.,Rehman,S.&Rehman,I.U.Ramanspectroscopyofbiologicaltissues.AppliedSpectrosco[0531]78.Xing,X.,Du,S.&Wang,K.RobustHessianLocallyLinearEmbedding[0532]79.Rivenbark,A.G.,O’Connor,S.M.&Coleman,W.B.MolecularandCellularHeterogeneityinE.UnveilingthePotentialofLiquidBiopsyinHER2_PositiveBreastCancerfromMetastaticBreastCancerPatientsUsingaSize_BasedMicrofluidicDevice.Cancers13,4446(2021).82.Pupa,S.M.etal.HER2SignalingandBreastCancerStemCells:TheBridgebehindHER2_PositiveBreastCancerAggressivenessandTherapyRefractoriness.Cancers(B[0535]83.Li,X.etal.UncoveringtheSubtype_SpecificMolecularCharacteristicsofBreastCancerbyMultiomicsAnalysisofPrognosis_AssociatedGenes,DriverGenes,SignalingPathways,andImmuneActivity.Front[0536]84.Fan,L.,Ma,L._X.,Zhou,P.&Shao,Z._M.At