CN119452254A 用于确定dna病毒中的dna浓度的方法 （万迈医疗仪器有限公司）

2024.10.15PCT/US2023/0658542023.04.17WO2023/205609EN2023.10.26本发明涉及一种确定DNA病毒中的DNA浓度步骤是将限定量的病毒衣壳颗粒捕获在第一固相上。第二步骤是裂解衣壳以将该病毒DNA从该的衣壳的总DNA。本发明还涉及一种用于测量完定病毒中的ssDNA浓度，然后使用针对完整衣壳的％的标准物绘制的具有DNA浓度的校准曲线将2(b)将第一探针尖端浸渍在包含病毒样品的样品溶液中，以在限定的结合条件下将所(d)将所述第一探针浸渍在裂解溶液中，并从所述第一探针尖端裂解所述病毒以获得(e)将在所述探针尖端上包含第一蛋白质的第二探针浸渍在所述裂解溶液中，其中所(g)将所述第二探针浸渍在HRP底物溶液中，以使底物与结合在所述第二探针上的HRP(a)获得第一探针，所述第一探针具有固定在所述探针的所述尖端上的固定量的抗病(b)将所述第一探针尖端浸渍在包含病毒样品的样品溶液中，以将所述病毒捕获在所(d)将所述第一探针浸渍在裂解溶液中，并从所述第一探针尖端裂解所述病毒以获得(e)将在所述探针尖端上包含第一蛋白质的第二探针浸渍在所述裂解溶液中，其中所(f)将所述第二探针浸渍在包含生物素标记的第二蛋白质的试剂溶液中，其中所述第(g)将所述第二探针浸渍在包含含有链霉亲和素和辣根过氧化物酶(HRP)的缀合物的(h)将所述第二探针浸渍在HRP底物溶液中，以使所述底物与所述缀合物中的所述HRP且对照校准曲线对所述波长偏移进行定量以确定所述ssD5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所310.一种用于测量病毒样品中完整病毒衣壳的百分比的方法；所述方法包括首先根据(c)基于所述样品的所述第一波长偏移与(i)校准物的第一波长偏移或(ii)所有校准(f)将在所述探针尖端上包含第一蛋白质的第二探针浸渍在所述裂解溶液中，其中所(i)对照针对完整AAV衣壳的％绘制的具有归一化的波长偏移的校准曲线来对所述归物样品的归一化的偏移并针对完整AAV衣壳的百分比对归一化的波长偏移作图来建立所述4病毒(AAV))中的DNA浓度以及确定空病毒衣壳与完病毒颗粒由围绕蛋白质核的二十面体蛋白质壳体(衣壳)组成，该蛋白质核含有线性双链[0004]腺相关病毒(AAV)已成为基因疗法临床试验的载体选择，因为它们在人类中长期[0005]近年来，含有封装到蛋白质衣壳中的DNA转基因的AAV载体显示出巨大的治疗潜的增强的免疫应答以及通过受体竞争对效力的潜在损害。空衣壳不能提供预期的治疗益有能够提供关于AAV衣壳的内容物分布(称为衣壳内容物)的信息[0006]有效定量AAV滴度和通过空/完整(E/F)衣壳比率确定DNA转基因含量是开发和制5[0011]图3示出了制备交联FICOLL8(蔗糖和表氯醇的共聚物)400_SPDP的流程图。[0012]图4示出了制备链霉亲和素/HRP_交联FICOLL8缀合物的流程图。[0013]图5示出了制备抗荧光素_交联FICOLL8的流程图。[0029]权利要求和说明书中使用的术语应根据本领域技术人员所理解的它们的通常含6[0040]本发明提供了确定病毒中的DNA浓度和确定空病毒衣壳与完整病毒衣壳比率的方一固相被设计用于特异性病毒捕获，其中与样品中的干扰物质的非特异性结合可忽略不方法的特征在于三个基本步骤，用来确定DNA病毒(诸如AAV)中的DNA浓度并确定空衣壳与传感器探针尖端测量来源于所捕获的衣壳的总DNA。由于衣壳颗粒的量在初始捕获步骤中7于将具有不同波长的光引导到探针108上的适当滤光文进一步描述的，由第一反射表面和第二反射表面反射的光可形成可由干涉仪100监测的案的相位特性的偏移来监测沿着探针108的远侧端部形成的生物基板的相对端部处基本上彼此平行布置的第一表面和第二表面。干涉层通常会由氟化镁度可以基于由第一反射表面和第二反射表面反射的光的度对宽度)至少为5比1。在此类实施方案中，可以说单片基板202具有柱状形式。单片基板有基本上高于干涉层204的折射率的折射率，使得干涉层204的近侧表面有效地反射被引导8204具有大约900nm至1,000nm或940n针200的远侧端部的反射主要是由于分析物分子208而不是干涉层204与分析物结合分子206之间的界面。在一些实施方案中，干涉层分子308形成的生物层通常会具有几nm以基于由这两个反射表面反射的光束的干涉来估计。当分析物分子208附着到分析物结合200中所有其他部件的尺寸保持相同，因此由第一反射表面和第二反射表面反射的光形成表面处被反射，从而产生第二反射光信号214。第二反射表面最初对应于分析物结合分子析物分子与干涉层的远侧表面上的分析物结合分子结合时，第二反射光信号的光路将变析物分子与固定在干涉层204的远侧表面上的分析物结合分子的缔合速率可以用于计算样9[0060]本发明涉及通过生物层干涉测量法来确定DNA病毒(诸如腺相关病毒(AAV)、腺病毒和1型单纯疱疹病毒(HSV_1))中的D端浸渍在包含病毒样品的样品溶液中，以在限定的结合条件下将该病毒捕获在该探针上；解溶液中移除该第一探针；(e)将在该探针尖端上包含第一蛋白质的第二探针浸渍到该裂霉亲和素和辣根过氧化物酶(HRP)的缀合物的缀合物溶液中，以使该缀合物与该第二探针[0066]将蛋白质(诸如抗体)固定到固相(探针尖端的感测表面)的方法在免疫化学中是的抗病毒的量是固定的并且结合条件是固定的，在不同的样品中捕获大约相同量的病毒。[0068]该步骤提供了本发明的一个重要方面：AAV的捕获被标准化为样品与样品之间的[0071]在步骤(e)中，将在探针尖端上包含第一蛋白质的第二探针浸渍在裂解溶液中一[0073]在步骤(f)中，将第二探针浸渍在包含生物素标记的第二蛋白质的试剂溶液中一蛋白质和第二蛋白质独立地是针对ssDNA的抗体[0079]在一个实施方案中，高分子量缀合物包含链霉亲和素和HRP，其中链霉亲和素和树枝状体或聚乙二醇。在一个优选的实施方案中，聚合物是FICOLL8(蔗糖和表氯醇的共[0082]在步骤(h)中，将该第二探针浸渍在HRP底物溶液中以使底物与缀合物中的HRP结[0084]在步骤(i)中，通过测量由于光干涉引起的波长偏移来确定样并且对照校准曲线对波长偏移进行定量以确定ssDNA浓度。可以动态地监测相位偏移或者通过开始时间点(T0)和结束时间点(T1)之间[0085]在上述结合步骤和洗涤步骤中，任选地通过搅拌或混合容器中的溶液来加速反500rpm、例如50rpm至200rpm或500rpm至1，500rpm的速度旋转。另外，探针尖端可以以者可以选择确定除总DNA之外的特定序列。后从该裂解溶液中移除该第一探针；(e)将在该探针尖端上包含第一蛋白质的第二探针浸HRP结合一段时间；以及(h)通过测量由于光干涉引起的波长偏移来确定该样品中的ssDNA[0092]在步骤(f)中，将第二探针浸渍在包含与DNA结合的HRP标记的第二蛋白质的缀合用针对完整病毒衣壳标准物的％绘制的具有DNA浓度的校准曲线将ssDNA浓度转化为完整使用两种探针(抗病毒探针和抗ssDNA[0105]如果标准物和样品具有不同的病毒浓度或不同数量的捕获的衣壳，病毒(例如，[0106]在使用归一化来确定空衣壳/完整衣壳比率时，通过与一种或多种校准物的病毒的ssDNA信号(波长)乘以归一化因子以产生样品的归一化的波长偏移值。校准物在相同的病毒浓度下运行并用于产生BLI信号与空病毒衣壳/完整病毒衣壳比率的关系的标准曲线。后从标准曲线确定样品的空/完整比率。由于归一化的波长偏移值考虑了由于样品中的不同病毒浓度引起的捕获差异，因此在一些情况下，归一化可以更准确以便计算空/完整比而测量由于该探针上的结合病毒引起的光干涉所致的第一波长偏移；(c)基于该样品的该第一波长偏移与(i)校准物的第一波长偏移或(ii)所有校准物的第一波长偏移的平均值的然后从该裂解溶液中移除该第一探针；(f)将在该探针尖端上包含第一蛋白质的第二探针渍在包含含有链霉亲和素和辣根过氧化物酶(HRP)的缀合物的缀合物溶液中，以使该缀合[0109]在步骤(c)中，通过将该样品的与该探针结合的病毒的该第一波长偏移与一种或多种校准物的第一波长偏移进行比较来确定该归物来建立归一化因子。该归一化因子是通过该样品的该第一波长偏移与(i)校准物的第一[0110]在步骤(i)中，通过将归一化的因子应用于该第二波长偏移来计算该第二波长偏[0111]在步骤(i)中，通过对照校准曲线来对归一化的波长偏移进行定量以确定该样品一化的偏移并针对完整病毒衣壳的百分比对归一化的波长偏移针尖端浸渍在包含DNA病毒样品的样品溶液中，以在限定的结合条件下在该探针上捕获该基于该样品的该第一波长偏移与(i)校准物的第一波长偏移或(ii)所有校准物的第一波长偏移的平均值的比较来确定归一化因子；(d)将该第一探针浸渍在洗涤溶液中以洗涤该第测量由于光干涉引起的该第二波长偏移；(i)将该归一化因子应用于该第二波长偏移以产移的校准曲线来对该归一化的第二波长偏移进行定量，以确定该样品中完整AAV衣壳的百优选地具有至少4个链霉亲和素和至少4个HRP。在一个实施方案中，交联FICOLL8具有500,000道尔顿至1千万道尔顿或1百万道尔顿至1千万道尔顿的分子量，并且每个交联FICOLL8结合至少2个HRP和至少2个链霉亲和素。在一个实施方案中，交联FICOLL8具有至少2百万道尔顿(例如，1百万道尔顿至1千万道尔顿)的分子量，并且每个交联FICOLL8结合至少4个或5个HRP和至少4个或5个链霉亲和素。在一个实施方案中，交联FICOLL8具有至少2百万道尔顿或至少5百万道尔顿(例如，2百万道尔顿至1千万道尔顿或5百万道尔顿至1千万道尔顿)的分子量，并且每个交联FICOLL8结合至少10个HRP和至例如，每个交联FICOLL8分子结合至少4个至10个HRP和4个至10个链霉亲和素。病毒和1型单纯疱疹病毒(HSV_1))中的在限定的结合条件下将该病毒捕获在该第一固体表面上；(c)用洗涤溶液洗涤该第一固体使含ssDNA的裂解溶液与固定有第一蛋白质的第二固体表面接触，其中该第一蛋白质与TM)或放射性同位素。[0128]用于使用两种不同的固体表面和用于检测的BLI来确定DNA病毒中的DNA浓度的方法[0129]本发明还涉及确定DNA病毒(诸如腺相关病毒(AAV)、腺病毒和1型单纯疱疹病毒(HSV_1))中的DNA浓度的方法，该方法使用两种不同的用于捕获病毒衣壳的固体表面以及在限定的结合条件下将该病毒捕获在该第一固体表面上；(c)用洗涤溶液洗涤该第一固体确定该样品中的ssDNA浓度，并且对照校准曲线对该波长偏移进行定量以确定该ssDNA浓针浸渍在包含含有链霉亲和素和HRP的缀合[0141]通过分光光度计(ThermoBioMate3S)进行UV/VIS测量。通过离心机(Beckman盐。通过在与CytivaAKTAGo纯化系统连接的XK16x400柱中定制填充的CytivaCL一4B[0155]·ThermoScientificTMPierceTM96孔聚苯乙烯白色不透明微板，Fisher[0157]根据US2001/0312105的实施例1制备交联酸盐缓冲液添加到链霉亲和素溶液中。将在无水二甲基甲酰胺(DMF)30μL(MCR＝1)中的这种情况下，Cy5用作示踪剂，能够对随后制备的Cy5_链霉亲和素/HRP_交联合物中的链霉亲和素含量进行定量。新鲜制备在无水二甲基甲酰胺(DMF)中的10mg/ml加到上述Cy5标记的链霉亲和素中。使SMCC标记反应在室温再运行1小时。按照Thermo酰亚胺甲基)环己烷_1_羧酸琥珀酰亚胺酯添加到HRP溶液中，使SMCC与HRP的摩尔比为MCR2分钟。收集纯化的样品，并通过分光光度计以280nm吸收来估计马来酰亚胺标记的HRP的[0163]链霉亲和素/HRP交联FICOLL8的流程图如图4所描绘。交联FICOLL8一SPDP，通液收集巯基标记的交联FICOLL8。该样品与表1中的花菁5/马来酰亚胺标记的链霉亲[0166]将交联FICOLL8硫醇(1mg)与马来酰亚胺一链霉亲和素(1.1mg)和马来酰亚胺一[0168]图5代表用于制备抗荧光素一交联FICOLL8的流程图。将在1mlPBS中的1.5mg/ml的抗荧光素(JacksonImmunoResearch)与在DMF中的1.9μL5mg/ml的SMCC混合并在室温[0169]交联FICOLL8一SPDP上的硫醇通在1mlPBS中的0.7mg交联FICOLL8400一SPDP并在室温反应1小时，随后通过PD然后将探针尖端浸入10μg/ml的鼠单克隆抗荧光素一交联FICOLL8(来自实施例5)的PBS[0172]然后将探针尖端浸入含有10μg/ml的荧光素标记的鼠单克隆抗ssDNA(Sigma目录抗ssDNA(Sigma目录号MAB386[0174]图6例示了进行针对ssDNA的测定的步骤。将抗ssDNA探针(实施例6)浸入ssDNA样品中，随后洗涤，然后浸入B一抗ssDNA试剂中，随后洗涤，然后浸入链霉亲和素/HRP一亲和素(SA)/HRP试剂是：(i)SA/HRP_交联FICOLL8,(ii)HRP_SA缀合物(ThermoFisher，[0178]在表2中示出了不同缀合物的结果。SA/H[0182]将包被有抗AAV的AAμL样品中，该样品含有在含BSA和吐温20的PBS缓冲液中的5x1010个vp(病毒颗粒)/mL的空[0185]在该实施例中，空AAV衣壳和完整AAV衣壳的混合物的200μL样品与AAVX生物传感捕获AAV的典型nm偏移，其在30分钟之后接近AAVX传感器上的平台期结合，如通过并将含有衣壳DNA的样品放回Gator8Prime仪器中，并且进行如实施例7所述的针对ssDNA[0193]在以下实施例中，例示了如何使用归一化方法来计算稀释至不同浓度的AAV样品[0194]用PBS稀释AAV8样数据显示出如预期的以下顺序的波长偏移2E11个vp/ml>8E10个Vp/ml>3E10个[0195]通过使用软件，我们提取了图16中每个结合曲线的端点，并对重复BLI数据求平[0196]表3.[0200]表4.[0202]然后使用归一化的偏移值来确定在不同的浓度下样品的空/完整比率。根据通过其进行测试以观察BLI数据的归一化是否可以可靠地用于确定样品的空/完整比率。总之，通过使用归一化因子，在不同的AAV浓度下确定的每个样品的空/完整比率彼此非常相似(1mg在1mLPBS中)与SMCC(摩尔偶联比率MCR＝8，20mg/mL在DMF中，0.89μL，Thermo(EDC)和10mMN羟基琥珀酰亚胺(NHS)的50mMMES缓冲液(pH＝6)中，并使其反应30分钟。[0209]将0.1mg/ml的生物素_抗AAVX(Thermo，CaptureSelect)的7μL等分试样添加到1mg/ml的100μL链霉亲和素包被的磁性颗粒(实施例14)中，并在室温在轨道混合下温育30[0212]两个AAV样品(Virovek，完整#AAV8_CMV_GFP)通过初始用GatorBioAAV探针(#160017)按照制造商的方案滴定并在PBS缓冲液中稀释至1.4×1011个vp/ml和6.1×109个vp/ml来制备。将抗AAV包被的磁性颗粒(实施例15)的25μL等分试样添加到500μLAAV样品AAV探进行测定以确定上清液中未捕获的衣壳。来自磁性颗粒捕获之前和之后的起始衣壳读数器，按照制造商的方案，在GatorBioAAV比率试剂盒(#35004)中用ssDNA测定测量除去上清液，并用洗涤缓冲液洗涤包被的珠3次至4次，并且再悬浮于200μLPBS中用于[0238]·进行移液以通过磁力分离从珠除去溶液并将溶液单独转移到新的Eppendorff[0259]将抗ssDNA/dsDNA抗体与FITC缀合，并使用来自BioVision的EZLabelTM蛋白质