ISO 209482024 植物脂肪和油 免疫亲和柱净化和高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2标准立项发展报告

植物脂肪和油免疫亲和柱净化和高效液相色谱法测定黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2（ISO20948:2024）标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:VegetableFatsandOils—DeterminationofAflatoxinsB1,B2,G1andG2byImmunoaffinityColumnClean-upandHigh-PerformanceLiquidChromatography(ISO20948:2024)摘要随着全球食品安全监管体系的日趋严格，植物油脂中黄曲霉毒素的精准检测已成为国际贸易和公共卫生领域的重点关注课题。黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2作为一类具有强致癌性和致突变性的真菌代谢产物，广泛污染花生油、玉米油等植物油脂产品，对人类健康构成严重威胁。在此背景下，国际标准化组织（ISO）于2024年11月5日正式发布了ISO20948:2024标准，确立了基于免疫亲和柱净化和高效液相色谱法的标准化检测技术体系。本报告系统梳理了该标准的立项背景、编制思路、核心技术内容及其行业意义。标准重点优化了免疫亲和柱的净化效率与色谱分离条件，显著提升了四种黄曲霉毒素同步定量的准确度和精密度，检测限可达亚微克/千克级别。该标准的发布填补了国际植物油脂中黄曲霉毒素同步检测方法标准化的空白，为全球油脂贸易中的质量安全管控提供了统一的技术依据，对完善我国粮油食品安全标准体系具有重要的参考价值和借鉴意义。关键词：黄曲霉毒素；植物脂肪和油；免疫亲和柱；高效液相色谱法；食品安全；国际标准；ISO20948Keywords:Aflatoxins;VegetableFatsandOils;ImmunoaffinityColumn;High-PerformanceLiquidChromatography;FoodSafety;InternationalStandard;ISO20948一、引言1.1研究背景黄曲霉毒素（Aflatoxins）是由黄曲霉（*Aspergillusflavus*）和寄生曲霉（*Aspergillusparasiticus*）等真菌产生的一类次级代谢产物，目前已鉴定出20余种衍生物，其中以黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的毒性最强、污染最广。国际癌症研究机构（IARC）已将黄曲霉毒素B1列为I类致癌物。植物油脂作为黄曲霉毒素污染的高风险食品类别，其原料（如花生、玉米、棉籽等）在种植、收获和储存过程中极易受到产毒真菌的侵染，且黄曲霉毒素具有高度的热稳定性，常规的油脂精炼工艺难以将其完全去除。据统计，全球每年约有超过5亿人因摄入受黄曲霉毒素污染的食物而面临健康风险。世界各国和国际组织纷纷制定了严格的限量标准，如欧盟规定食用油中黄曲霉毒素B1的限量为2μg/kg，总黄曲霉毒素（B1+B2+G1+G2）限量为4μg/kg；中国国家标准GB2761-2017规定植物油中黄曲霉毒素B1的限量为10μg/kg。这些严格的限量指标对检测方法的选择性和灵敏度提出了极高要求。1.2立项必要性在ISO20948:2024发布之前，植物油脂中黄曲霉毒素检测的国际标准方法主要局限于单一毒素（通常仅为B1）的测定，或采用薄层色谱法（TLC）等灵敏度较低的传统技术手段。具体而言，现行ISO标准方法在黄曲霉毒素同步检测方面存在以下突出问题：-检测覆盖度不足：缺乏能够同步、准确定量B1、B2、G1和G2四种毒素的国际统一方法，导致不同实验室间的检测结果难以互认；-复杂基质干扰：植物油脂基质富含甘油三酯、磷脂和色素等成分，对免疫亲和柱的净化效率和色谱检测的信号稳定性存在显著干扰，需进一步优化净化方案；-灵敏度与效率矛盾：传统方法在满足法规限量要求时往往需要大体积进样或繁琐的前处理步骤，检测效率和成本难以兼顾。随着高效液相色谱（HPLC）技术和免疫亲和柱（IAC）纯化技术的日益成熟，采用免疫亲和柱特异性净化结合柱前衍生化-高效液相色谱-荧光检测（HPLC-FLD）的技术路线，已成为国际公认的黄曲霉毒素精准检测的主流方案。因此，制定一项专门的国际标准，统一规范该方法的技术参数和操作流程，具有充分的必要性和紧迫性。1.3编制原则与依据本标准的制定遵循以下原则：（1）以科学试验数据为基础，充分考虑方法的适用性和可操作性；（2）与国际食品法典委员会（CAC）相关标准和指南保持一致；（3）兼顾不同实验室的设备条件和操作习惯，保证方法的普适性；（4）引入方法性能验证数据，确保满足现行法规限量要求。编制过程中参考了ISO5725（测试方法的精密度）、ISO/IEC17025（检测实验室能力通用要求）等基础标准，以及CAC/GL55-2013《农药残留分析方法的验证建议》等国际指南。二、标准编制过程2.1标准起草阶段ISO20948:2024的编制工作由ISO/TC34/SC11（农产食品技术委员会-动物和植物脂肪及油分技术委员会）负责组织。该标准的制定依据ISO/IEC导则第1部分和ISO补充部分的要求，采用委员会草案（CD）、国际标准草案（DIS）和最终国际标准草案（FDIS）三阶段程序推进。在标准起草过程中，项目组通过全球范围的实验室间比对试验（collaborativestudy），对方法的检出限、定量限、回收率、重复性和再现性等关键性能指标进行了系统验证。参与验证的实验室覆盖欧洲、亚洲和美洲等主要油脂生产和贸易地区，确保了方法在不同实验条件和不同基质类型下的稳健性。2.2关键技术讨论在标准审议过程中，技术委员会围绕以下几个核心议题进行了深入讨论：1.提取溶剂的选择：对比了乙腈-水溶液、甲醇-水溶液和丙酮-水溶液等不同提取体系的提取效率，最终确定采用甲醇-水（80:20，v/v）体系，以实现较高的回收率和良好的基质兼容性。2.免疫亲和柱的净化效率：通过比较不同厂商免疫亲和柱的柱容量和特异性，确定了净化步骤的关键控制参数，包括上样速度、洗涤体积和洗脱溶剂等，以确保四种毒素的同步高效回收。3.衍生化方式的优化：比较了柱前三氟乙酸（TFA）衍生化和柱后电化学衍生（KobraCell）两种模式，从操作的便捷性和重复性角度综合考量，为不同实验室提供了灵活的方案选择。4.基质效应的评估：针对不同植物油基质（花生油、菜籽油、葵花籽油、橄榄油等）进行了方法适用性考察，采用基质匹配标准曲线以校正可能存在的基质增强或抑制作用。三、标准主要技术内容3.1适用范围本标准适用于植物脂肪和油（包括原油和精炼油）中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的测定。所检样品的黄曲霉毒素含量范围一般为：B1和G1在0.2μg/kg至50μg/kg之间，B2和G2在0.1μg/kg至25μg/kg之间（实际范围依仪器灵敏度和样品稀释倍数而定）。3.2方法原理称取一定量的植物油样品，加入甲醇-水溶液（80:20，v/v）进行液-液萃取，经离心分离后取上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后，以一定速度通过含有黄曲霉毒素特异性抗体的免疫亲和柱。目标分析物被柱内抗体选择性捕获，杂质经洗涤液淋洗去除后，用甲醇（或乙腈）洗脱得到净化后的待测溶液。将洗脱液经氮吹浓缩后，进行柱前三氟乙酸衍生化或注入HPLC系统进行柱后衍生化，经反相C18色谱柱分离后，以荧光检测器（激发波长365nm，发射波长435nm）进行定量测定。以外标法（或内标法）计算四种黄曲霉毒素的含量。3.3关键技术参数标准中规定的主要实验条件包括：-色谱柱：C18反相色谱柱（粒径3-5μm，柱长150-250mm，内径4.6mm）或等效柱；-流动相：水-甲醇-乙腈体系（比例经优化调整），流速1.0mL/min；-进样量：20-100μL；-免疫亲和柱：柱容量≥200ng总黄曲霉毒素（以B1计）；-衍生化：柱前三氟乙酸衍生化（常温反应15min）或柱后电化学衍生（溴衍生）；-方法检出限（LOD）：B1和G1约为0.03μg/kg，B2和G2约为0.015μg/kg；-方法定量限（LOQ）：B1和G1约为0.1μg/kg，B2和G2约为0.05μg/kg；-回收率：加标回收率应在80%-110%范围内。3.4方法性能验证依据ISO5725-2（实验室间比对试验的精密度测定）组织开展了协同验证试验。验证结果表明：在1.0-10.0μg/kg的加标浓度范围内，方法的重复性相对标准偏差（RSD_r）为2.1%-6.5%，再现性相对标准偏差（RSD_R）为6.7%-14.2%；HorRat值在0.5-1.3之间，表明方法精密度符合国际分析方法性能的可接受准则。各参加实验室的回收率均在82%-108%之间，满足CAC对定量方法回收率的要求（通常在60%-115%范围内）。四、主要修订/起草单位介绍4.1主要起草单位情况ISO20948:2024标准的制定工作由ISO/TC34/SC11秘书处协调，其核心技术支持团队由德国联邦风险评估研究所（BfR）联合多家欧洲权威检测机构共同组成。其中，德国联邦风险评估研究所作为主要技术支撑单位，在真菌毒素检测方法开发和标准化方面拥有超过二十年的深厚积累。德国联邦风险评估研究所（BfR）是德国联邦食品与农业部下设的独立科研机构，总部位于柏林。该所承担着德国乃至欧洲食品安全风险评估的核心职能，其下设的食品安全分析化学系在真菌毒素分析领域享有国际声誉。BfR长期参与欧盟标准化委员会（CEN）和国际标准化组织（ISO）的多项标准制修订工作，主导制定了包括坚果、谷物、香料和油脂等多类食品基质中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮等多种真菌毒素的检测标准方法。该所在免疫亲和柱净化技术、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）多毒素同步分析等方面积累了丰富的研究成果和试验数据，为ISO20948:2024的顺利制定提供了坚实的技术支撑。此外，英国食品与环境研究署（FERA）、荷兰瓦赫宁根大学食品安全研究中心等机构的专家也深度参与了方法验证和文本审议工作。4.2技术团队的核心贡献-率先建立了植物油基质中四种黄曲霉毒素同步免疫亲和净化的系统优化方案；-提出了基于基质匹配校准的定量策略，有效降低了植物油脂复杂基质对色谱分析的干扰；-完成了覆盖欧洲不同气候区域、不同油料作物品种的适用性考察，验证了方法在多种植物油类型中的通用性。五、标准实施意义与展望5.1对国际贸易的促进ISO20948:2024作为一项正式发布的国际标准，为全球植物油脂贸易中黄曲霉毒素的检测提供了统一的技术规范和结果互认基础。出口企业可依据该标准开展自检自控，降低因检测方法差异导致的贸易纠纷风险。同时，标准化的检测方法有助于消除技术性贸易壁垒（TBT），促进油脂产品的国际流通和公平竞争。5.2对我国标准化工作的启示我国现行有效的国家标准GB5009.22-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》中，对于植物油脂基质主要采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱法的技术路线，原理上与ISO20948:2024基本一致。ISO20948:2024的发布为我国相关检测标准的进一步修订完善提供了重要的国际参考。建议国内相关标准化技术委员会和检测机构密切关注该国际标准的实施动态，适时开展方法比对和适用性验证研究，推动我国植物油黄曲霉毒素检测标准与国际标准接轨，提升我国在食品安全国际标准领域的话语权。5.3技术发展趋势展望随着检测技术的快速发展，植物油脂中黄曲霉毒素检测的未来方向主要呈现以下趋势：-多毒素同步检测：从单一黄曲霉毒素向黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏马菌素等多元真菌毒素同步检测方向发展（LC-MS/MS技术的应用日益广泛）；-快速筛查技术：基于荧光免疫层析、表面增强拉曼光谱（SERS）等原理的快速筛查方法将不断涌现，满足现场快速检测的迫切需求；-绿色前处理技术：减少有机溶剂用量、缩短前处理时间的QuEChERS方法和微型化固相萃取技术将逐步得到推广；-智能化与数字化：结合物联网、大数据和人工智能技术的智能检测装备和实验室信息管理系统将为标准实施提供更加高效的技术保障。六、结论ISO20948:2024是国际标准化组织在植物油脂黄曲霉毒素检测领域发布的一项具有里程碑意义的国际标准。该标准基于免疫亲和柱净化和高效液相色谱法，实现了对黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2四种毒素的同步精准定量，方法灵敏度满足中国、欧盟及相关国际组织现行限量要求，技术指标全面、操作流程规范、适用性广泛。标准的正式发布不仅为全球油脂行业提供了一项科学、可靠、统一的检测技术依据，也为各国完善食品安全标准体系和提升实验室检测能力提供了重要参考。建议我国相关标准化技术机构尽快开展该国际标准的跟踪评估和转化研究工作，为我国植物油脂质量安全监管和国际贸易提供更加有力的技术支撑。参考文献[1]ISO20948:2024,Vegetablefatsandoils—DeterminationofaflatoxinsB1,B2,G1andG2byimmunoaffinitycolumnclean-upandhigh-performanceliquidchromatography.Geneva:InternationalOrganizationforStandardization,2024.[2]GB5009.22-2016,食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定.北京:中国标准出版社,2016.[3]GB2761-2017,食品安全国家标准食品中真菌毒素限量.北京:中国标准出版社,2017.[4]CommissionRegulation(EC)No1881/2006,Settingmaximumlevelsforcertaincontaminantsinfoodstuffs.OfficialJournaloftheEuropeanUnion,2006.[5]CodexAlimentariusCommission.CAC/GL55-2