宏基因组二代测序临床应用专家共识总结2026

宏基因组二代测序临床应用专家共识总结目录contents01证据与推荐分级02临床应用范围03流程与质量控制04结果解读与验证证据与推荐分级证据强度的四级分级标准证据质量的三种来源等级证据强度与质量的结合应用证据强度分为A、B、C、D四级：A为强烈推荐，B为推荐但其他替代方案可接受，C为推荐强度低需寻求替代方案，D为从不推荐。该分级用于指导临床决策，体现推荐力度差异。证据质量分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三级：Ⅰ级来自随机对照试验，Ⅱ级来自非随机对照试验，Ⅲ级仅来自专家意见。质量等级反映证据可靠性，Ⅰ级最高，Ⅲ级最低，为推荐强度提供依据。共识中推荐意见均标注证据强度与质量等级，如(A，Ⅱ)表示强烈推荐且证据来自非随机对照试验。临床使用时应综合两者判断推荐依据的可靠程度，避免仅凭强度而忽略质量层级。证据强度定义证据质量共分三级：Ⅰ级为证据来自随机对照试验，Ⅱ级为证据来自非随机对照试验，Ⅲ级为证据仅来自专家意见。该分级体系为二代测序临床应用推荐意见提供了循证医学依据。本共识中推荐意见均标注证据等级，如“A，Ⅱ”表示强烈推荐且证据来自非随机对照试验，“B，Ⅲ”表示推荐但证据仅来自专家意见。临床解读时需结合证据等级判断推荐依据的可靠程度。高等级证据（Ⅰ、Ⅱ级）多来源于试验研究，支持较强推荐；低等级证据（Ⅲ级）仅基于专家意见，适合临床个体化决策。应用二代测序时，应依据证据质量权衡检测时机与结果解读的确定性。证据质量分级定义证据质量与推荐强度关联证据质量分级指导临床实践证据质量分级010203推荐意见依据急性感染患者完成常规生化培养后3天未明确病原且经验治疗无效时推荐测序；慢性感染及随访可首选，因二代测序能检出罕见病原体，提高检出率。中枢神经系统感染二代测序推荐时机的依据血流感染病原体多数以DNA为遗传物质，故推荐DNA测序；血培养3天未报阳且经验治疗无效时，检测留存标本；血培养与二代测序有互补性，应尽快送检。血流感染标本留取与检测推荐的依据呼吸道感染患者3天内传统检查未明确且经验治疗无效时推荐测序；高度怀疑病毒性肺炎时先多重PCR，阴性再测序并反转录；二代测序可检罕见病原和混合感染，但不能替代传统检测。呼吸道感染二代测序推荐顺序的依据临床应用范围对于疑似中枢神经系统急性感染或病毒感染的患者，推荐在抽取脑脊液时同步留取2mL标本，保存于-16～20℃冰箱，以备后续二代测序检测，避免重复穿刺。脑脊液样本采集与保存完成常规生物化学检查和培养后，若3天内未获得明确病原学依据且经验性抗感染治疗无效，或传统PCR检测阴性，推荐对留存脑脊液标本进行二代测序检测。二代测序的检测时机对于慢性中枢神经系统感染及需要随访病原学证据的患者，可首选二代测序检测，因其能有效检出罕见、少见病原体，提高病原学确诊概率。慢性感染及随访患者的应用中枢神经感染血流感染二代测序的标本采集与保存继发性血流感染的二线检测应用血流感染二代测序的检测范围与方法选择疑似血流感染时，建议同步留取2mL血标本，分离血浆后保存于-16～20℃冰箱。血培养3天未报阳且经验性抗感染治疗无效时，再对留存标本进行二代测序检测。对于怀疑继发性血流感染的患者，若原发感染灶病原学检测阴性或因各种因素无法送检合适标本，可考虑将血标本二代测序作为二线检测方法，以辅助明确病原体。血流感染二代测序可覆盖细菌、真菌、病毒及不典型病原体等。因多数病原体以DNA为遗传物质，推荐首选DNA测序；仅在怀疑RNA病毒感染时，再进行RNA测序。血流感染适用怀疑局灶性感染时，若局灶部位常规生物化学、培养或PCR检测未获病原学诊断，推荐将二代测序作为二线首选检测手段，以提高皮肤软组织、骨关节、眼内、尿路等感染的病原学检出率。局灶性感染二代测序适用时机呼吸道感染患者3天内传统检查未明确病原且经验性抗感染无效，推荐留取呼吸道标本行二代测序。免疫抑制或危重患者应在送检传统检测同时尽快送检二代测序，以明确罕见病原体或混合感染。呼吸道感染二代测序应用指征高度怀疑病毒性肺炎且病情持续进展者，先完善呼吸道病毒多重PCR检测；若阴性，再行二代测序，并同时进行核酸RNA反转录，以兼顾DNA和RNA病毒检测。病毒性肺炎二代测序检测策略局灶呼吸道感染流程与质量控制010302严格无菌操作与无菌容器采样优先采集感染部位标本特殊情况下可采集血液标本采集样本送检二代测序必须严格遵守无菌原则。对于静脉血、脑脊液、胸腔积液等无菌体液，采集前需对皮肤充分消毒，待干燥后取样，并收集第2管标本置于无菌容器内，避免污染影响检测结果。样本应直接从患者感染部位的体液或组织中采集，如肺泡灌洗液、局灶穿刺物等，以提高病原体检出可信度。若感染部位采样困难，可考虑采集外周血，但需注意其可能降低检测准确性，且应尽量靠近病灶取材。当患者存在感染表现但病情危重或不能耐受有创操作时，可考虑采集血液标本送检。血液样本需根据检测需求决定是否离心分离血浆，并按要求保存运输，避免冻融环节，确保核酸质量满足后续测序要求。样本采集要求不同感染部位样本需先灭活处理，痰液需液化，组织需切碎，血液可离心分离血浆。去除人源细胞可提高灵敏度，但需避免影响病原体含量，确保后续核酸提取质量。核酸质量是二代测序成功的关键，需测定完整性或降解程度并定量检测。文库制备包括片段化、末端修复、接头连接和PCR扩增等步骤，需严格保证核酸量满足实验要求。提取及建库试剂需考虑工程菌和环境微生物核酸残留的影响。每批次实验必须包含内参照、阴性对照品和阳性对照品，以评估操作或环境污染，确保检测流程无异常。样本前处理与核酸提取核酸质量与建库要求试剂污染防控与质控对照核酸提取建库010203质控与生物信息样本采集须严格遵守无菌原则，尽量直接取自感染部位体液或组织；无法耐受有创操作时可采血送检。运输需冷链，避免冻融，及时送检，以确保检测结果可信度。样本采集与送检质控不同样本需前处理及灭活，如痰液液化、组织切碎。核酸质量决定测序成败，须定量检测完整性。每批次应设内参照、阴性及阳性对照，严格防控污染，异常即终止。核酸提取与文库构建质控单样本特异性序列数建议不低于20M，读长不少于50bp；应采用临床应用级数据库，慎用公共库。报告需涵盖对照品结果、测序质量、序列数及相对丰度等质控参数。测序数据与生物信息分析质控结果解读与验证010203下机数据进入分析后，应剔除试剂、环境、测序及生物信息分析流程引入的假阳性病原体信息，真实呈现样本所含病原体核酸信息，避免污染干扰临床判断，确保报告结果可靠。报告原则上准确到种，同时包含属信息；根据病原体出现频度和临床致病性，将高度关注病原体单独呈现，常见定植菌等低致病性病原体另列，便于临床区分。建议对报告中呈现的所有病原体引用权威文献进行关键信息注释，提供微生物相关信息，帮助临床医师快速理解报告结果，并结合患者临床表现和实验室检查综合判读验证。假阳性信息剔除原则病原体报告分级与准确性要求报告文献注释与临床参考依据实验室判读原则010203二代测序结果必须结合临床综合解读需区分致病病原体与定植或污染菌二代测序可用于动态监测病原体载量变化二代测序结果应在与患者临床表现及实验室检查密切结合的前提下进行解读和验证，不能孤立看待病原体检出信息，需综合感染部位、宿主免疫状态及传统检测结果，避免误判为致病或漏诊。报告中应将临床高度关注、健康人样本极少出现的病原体单独呈现，同时将呼吸道、皮肤、肠道等部位的常见低致病性或无致病性定植菌单独列出，结合患者具体情况判断其临床意义，以防过度治疗。二代测序可直接检测病原体匹配序列数，并结合宿主内标背景值半定量显示病原菌载量动态变化，对中枢神经系统感染等慢性病程患者，有助于随访病原学证据、评估疗效和调整抗感染方案。结合临床解读010203验证及辅助决策二代测序结果不能单独作为诊断依据，必须与患者临床表现、常规实验室检查及影像学结果密切结合。解读时应排除定植菌和污染干扰，关注高度致病性病原体，同时参考权威文献注释，由临床医师综合判断其意义，避免过度诊断或漏诊。二代测序有助于明确病原体，指导针对性抗感染方案的制定与调整。通过检测病原体序列数变化，可半定量监测病原体载量动态，辅助评估治疗反应。对于经验性治疗无效的疑难感染，二代测序结果可为更换药