CN119470927A 融合蛋白、重组载体、宿主细胞及蛋白-蛋白相互作用鉴定方法 （西北农林科技大学深圳研究院）

道高新南四道19号R4大楼虚拟大学园及蛋白蛋白相互作用鉴定方法。所述鉴定方法目标蛋白的相互作用蛋白与所述融合蛋白交联形成蛋白复合体；利用Avi标签进行生物素化处2将光敏蛋白、目标蛋白和生物素化受体标签进行融合表达，获得含有融合蛋白的对所述第一体系进行光照处理，使得所述目标蛋白的相互作用蛋白利用生物素化受体标签进行生物素化处理，分离纯化带有生物素标记的蛋白复合体，2.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述光敏蛋白选自miniSOG、SOPP2或3.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所4.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述光照处理是使5.根据权利要求1所述鉴定方法，其特征在于，所述生物素化处理是指加入腺苷三磷8.一种重组载体，其特征在于，由质粒载体中插3经光催化产生单线态氧，以邻近依赖性方式修饰约70nm范围内的邻近蛋白质的组氨酸残同样被探针所标记。所以该光激活依赖性邻近标记方法在应用于PPI研究时仍然存在检测[0005]本发明第二方面在于提供一种应用于蛋白一蛋白相互作用鉴定方法中的融合蛋[0006]本发明第三方面在于提供一种含有编码本发明第二方面所述融合蛋白的核酸分4生的一系列带有不成对电子的化学物质，这些物质具有很强的氧化性和争夺电子的能力。1O2[0011]光敏蛋白在经过光照处理后产生的活性氧自由基能够对发生相互作用的蛋白质活性氧自由基，而活性氧自由基将目标蛋白及其相互作用蛋白交联在一起形成蛋白复合[0014]在本发明的一些实施方式中，所述光敏蛋白选自miniSOG、SOPP2或SOPP3。[0016]在本发明的一些实施方式中，所述生物素化受体标签选自Avi标签或Avi标签变氨酸残基连接上一个生物素，从而实现融合蛋白的生物素化标记。所述Avi标签变体是指[0018]在本发明的一些实施方式中，所述第一体系为稳定表达所述融合蛋白的稳转细52）将所述核苷酸分子转入质粒载体，添加包膜质粒和包装质粒共转染至包装细稳转细胞进行裂解处理。由于所述光照处理已经完成了目标蛋白与其相互作用蛋白的交[0027]本发明第二方面所述融合蛋白中含有光敏蛋白、目标蛋白和生物素化受体标目标蛋白不会直接干涉所述光敏蛋白和所述生物素[0029]在本发明的一些实施方式中，所述目标蛋白选自LaminA蛋白、H2BC11蛋白或[0030]本发明第三方面所述重组载体由质粒载体中插入编码所述融合蛋白的核苷酸分6途径获得。和72小时后分别进行慢病毒颗粒的收集。养基中转染24小时。转染后更换正常的培养基，用5μg/mL的杀稻瘟菌素筛选获得稳转细7℃下以13000rpm离心10分钟以去除碎片，并使用BCA蛋白质测定试剂盒（Beyotime,#2然后加入1mL由25mmol/L碳酸氢铵(ABC,Aladdin,#A110539)溶解形成的8mol/L尿素(Aladdin,#U111902)溶液以溶解沉淀。[0050]（4）用含有0.2%SDS(Sangon,#A600485)的[0051]（5）通过离心收集树脂珠并重新悬浮在含有1mol/L尿素、1mmol/LCaCl2[0053]（7）用脱盐柱对溶液进行脱盐处理，脱盐后的溶液用真空浓缩干燥并储存在_20的方法对蛋白质组数据进行定量分析，通过R语言写好的代码对质谱数据进行火山图的绘制，内源生物素化蛋白Pyruvatecarboxylase、3_methylcrotonylcoAcarboxylase、PropionylcoAcarboxylase和AcetylcoAcarboxylase在实验组和对照组中的丰度理论[0055]从BCA定量完的溶液中取出部分进行WB实验检测V5标签信号，以确定光照是有交8[0056]图4和图5分别为各稳转细胞组经质谱数据分析后绘制的火山图。通过比较敏蛋白。因为LaminA和H2BC11的互组C为所述稳转细胞经20ng/mL的佛波酯（PMA）和10μmol/L的MG132共处理6小[0063]随后使用ProteomeDiscoverer数据处理软件，Labelfree的方法对蛋白质组数素化蛋白Pyruvatecarboxylase、3_methylcrotonylcoAcarboxylase、PropionylcoA照将活细胞中的midnolin蛋白与其互作蛋白共价交联在一起，之后在裂解液条件下对树脂珠富集，最后向结合了midnolin蛋白及其相互作用组的琼脂糖珠中加入Loading9照处理组则未发现交联现象。同时，通过AlphaFoldMultimer预测了所述融合蛋白与DNAJA1蛋白的PLDDT评分为54.9101，BSASA评分为2074.3672；融合蛋白与PPM1G蛋白的（1）293T中的EGR1蛋白随着血清刺激时间的延长在逐渐减少，而稳系细胞中的[0068]（3）Jun蛋白的表现与EGR1蛋白相同，说明其同样可能[0070]此前曾进行过midnolin蛋白与ATF4蛋白的互作验证实验，但由于抗体的局限性实验检测不出来未能在光照组检测到ATF4蛋白被下拉下来的信号。重新悬浮在冰冷的RIPA裂解液中进行裂解，BCA定量调整蛋白浓度后加入LoadingBuffer