分子印迹聚合物对血液中野百合碱-血红蛋白加合物的分析

分子印迹聚合物对血液中野百合碱-血红蛋白加合

物的分析

1引言

野百合碱（Monocrotaline,MCT）是一种广泛存在于菊科千里光属植物中的吐咯

里西碇类生物碱，具有显著的肝毒性、肺毒性及致癌性。当人体摄入含有野百合碱

的植物或相关制品后，其在体内经肝脏细胞色素P450酶系代谢活化，生成具有亲

电性的毗咯衍生物。这些活性代谢产物易与生物大分子发生共价结合，其中与血红

蛋白（Hemoglobin,Hb）形成的野百合碱-血红蛋白加合物（Monocrotaline-

HemoglobinAdduct,MCT-HbAdduct）具有稳定性高、留存时间长的特点，可作

为反映人体长期、低剂量暴露野百合碱的生物标志物。因此，建立高选择性、高灵

敏度的血液中MCT-HbAdduct分析方法，对于野百合碱暴露人群的健康风险评估、

早期毒性预警及相关疾病的诊断具有重要意义。

传统的生物标志物分析方法如高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）、气相色谱

-质谱联用法（GC-MS）等，虽在一定程度上可实现MCT-HbAdduct的检测，但

血液基质成分复杂，含有大量蛋白质、脂质、小分子代谢物等干扰物质，直接进行

检测易导致色谱峰重叠、灵敏度下降等问题。因此，在检测前需对样品进行复杂的

前处理操作，如蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等。其中，固相萃取技术因操作简

便、富集效率高而被广泛应用，但传统的固相萃取吸附剂（如C18、硅胶等）对

目标分析物的选择性较差，难以有效分离MCT-HbAdduct与基质干扰物。

分子印迹聚合物（MolecularlyImprintedPolymers,MIPs）是一类具有特定“分

子记忆”功能的高分子材料，通过在聚合过程中以目标分子（模板分子）为模板，

加入功能单体、交联剂和引发剂，在模板分子周围形成具有特定空间结构和结合位

点的聚合物网络。去除模板分子后，MIPs中留下的空穴可与模板分子或结构类似

物发生特异性结合，具有选择性高、稳定性好、制备成本低、可重复使用等优点，

在复杂基质中目标分析物的分离富集领域展现出广阔的应用前景。基于此，本文将

系统探讨分子印迹聚合物的制备方法、性能表征及其在血液中MCT-HbAdduct分

析中的应用，旨在为建立高效、准确的MCT-HbAdduct检测方法提供理论依据和

技术支持。

2野百合碱■血红登白加合物的形成机制与检测难点

2.1野百合碱•血红蛋白加合物的形成机制

野百合碱进入人体后，首先在肝脏中被细胞色素P450酶（主要为CYP3A4和

CYP2B6）催化氧化，其分子结构中的双稠毗咯咤环发生脱氢反应，生成具有高度

反应活性的脱氢野百合碱（Dehydromonocrotaline,DHMCT）。DHMCT的毗咯

环上存在两个亲电中心，可与生物大分子中的亲核基团（如蛋白质中的氨基、毓基,

核酸中的氨基等）发生亲电取代反应，形成共价结合的加合物。

血红蛋白作为血液中含量最丰富的蛋白质，其分子结构中含有4条多肽链（2条a

链和2条B链），每条链上均含有多个赖氨酸残基和半胱氨酸残基，这些残基中的

氨基（-NH2）和弱基（-SH）是重要的亲核位点。DHMCT可与血红蛋白赖氨酸残

基的”氨基发生反应，形成稳定的N-烷基化加合物；同时，也可与半胱氨酸残基

的筮基发生反应，形成S-烷基化加合物。其中，N-烷基化加合物因氨基的亲核性

更强、反应活性更高，成为MCT-HbAdduct的主要存在形式。该加合物一旦形成,

便会随着血红蛋白的生命周期（约120天）在血液中稳定存在，且不受短期代谢

波动的影响，可作为反映人体在较长时间内野百合碱暴露水平的理想生物标志物。

2.2血液中野百合碱•血红蛋白加合物的检测难点

血液基质的复杂性是导致MCT-HbAdduct检测难度较大的主要原因。血液中除了

含有大量的血红蛋白（约120-160g/L）外，还含有白蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白

等多种蛋白质，以及葡萄糖、氨基酸、脂质、无机盐等小分子物质。在MCT-Hb

Adduct的检测过程中，这些基质成分会对目标分析物产生严重的干扰，具体表现

为以下几个方面：

首先，基质中的蛋白质易与检测仪器的色谱柱或质谱离子源发生相互作用，导致色

谱柱污染、柱效下降，或产生较强的基质效应，抑制目标分析物的离子化效率，降

低检测灵敏度。其次，血液中的小分子杂质可能与MCT-HbAdduct具有相似的色

谱行为，在色谱分离过程中出现峰重叠现象，影响目标分析物的准确定量。此外，

MCT-HbAdduct在血液中的含量通常较低（一般在nmol/L至pmol/L级别），而

传统的检测方法由于选择性和灵敏度不足，难以直接对其进行检测，必须通过前处

理步骤对样品进行富集和纯化C

传统的前处理方法如蛋白沉淀法，虽可去除部分蛋白质杂质，但无法有效分离

MCT-HbAdduct与其他蛋白质结合物;液液萃取法操作繁琐，有机溶剂用量大，

且对极性较强的MCT-HbAdduct萃取效率较低；传统的固相萃取吸附剂因缺乏特

异性结合位点，对MCT-HbAdduct的富集倍数和选择性有限，难以满足痕量睑测

的需求。因此，开发具有高选择性的分离富集材料，是解决血液中MCT-Hb

Adduct检测难点的关键。

3分子印迹聚合物的制备与性能表征

3.1分子印迹聚合物的制备方法

针对MCT-HbAdduct的结构特点和分离需求，常用的MIPS制备方法主要包括本

体聚合、沉淀聚合、悬浮聚合和表面分子印迹聚合等。其中，表面分子印迹聚合因

可在载体表面形成厚度为一、结合位点分布均匀的印迹层，有效解决了传统本体聚

合中存在的模板分子包埋过深、洗脱困难、传质速率慢等问题，在生物大分子印迹

领域得到了广泛应用。以下将以表面分子印迹聚合为例，详细介绍MCT-Hb

Adduct印迹聚合物的制备过程：

3.1.1载体的选择与预处理

为提高MIPS的比表面积和机械稳定性，通常选择具有良好分散性和表面活性的材

料作为载体，如二氧化硅纳米粒子（SiO2NPs）、磁性纳米粒子（Fe3O4NPs）、

碳纳米管（CNTs）等。其中，磁性纳米粒子因具有超顺磁性，可通过外加磁场实

现快速分离，简化操作流程，成为MCT-HbAdduct印迹聚合物的理想载体。

以Fe3O4磁性纳米粒子为例，其预处理过程如下：首先，通过共沉淀法制备

Fe3O4纳米粒子，将FeCI3・6H2O和FeC124H20按照一定的摩尔比（通常为2:1）

溶解于去离子水中，在氮气保护下搅拌加热至80cl缓慢滴加氨水调节溶液pH

至10左右，继续反应30分钟，生成黑色的Fe3O4纳米粒子。随后，为提高载体

表面的反应活性，对Fe3O4纳米粒子进行硅烷化修饰，将其分散于乙醇和去离子

水的混合溶液中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）,在60C。下回流反应6

小时.使载体表面接枝氨基（-NH2），得到氨基修饰的磁忤纳米粒子

（Fe3O4@SiO2-NH2）o

3.1.2模板分子与功能单体的选择

模板分子的选择是制备MIPS的关键，直接影响聚合物的选择性。由于MCT-Hb

Adduct的分子量较大、结构复杂，直接以其作为模板分子进行聚合存在溶解度低、

成本高的问题。因此，通常选择与MCT-HbAdduct具有相似结构特征的小分子化

合物作为替代模板，如野百合碱标准品或其代谢产物脱氢野百合碱。这些替代模板

分子不仅易于获取和溶解，且其分子结构中的关键官能团（如毗咯环、酯基等）与

MCT-HbAdduct一致，可在聚合过程中形成与MCT-HbAdduct互补的结合位点。

功能单体的选择需根据噗板分子的结构特征，通过氢键、静电作用、疏水作用等非

共价相互作用与模板分子形成稳定的复合物。针对野百合碱及其代谢产物分子中含

有酯基（-CO。-）和氨基（-NH-）等极性官能团的特点，常用的功能单体包括甲

基丙烯酸（MAA）、丙烯酰胺（AM）、4-乙烯基毗咤（4-VP）等。其中，甲基丙

烯酸的竣基（-COOH）可与模板分子的酯基和氨基形成氢键相互作用，结合能力

强，是制备MCT-HbAdduct印迹聚合物的常用功能单体。

3.1.3聚合反应与模板分子洗脱

将预处理后的载体（Fe3O4@SiO2-NH2）分散于适当的溶剂（如甲醇-水混合溶液）

中，加入模板分子（如野百合碱）和功能单体（如MAA）,在室温下搅拌1小时,

使模板分子与功能单体充分结合形成复合物。随后，加入交联剂（如乙二醇二甲基

丙烯酸酯，EGDMA）和引发剂（如偶氮二异丁月青，AIBN）,在氮气保护下，于

60C。下加热反应12小时，使功能单体和交联剂在载体表面发生聚合反应，形成表

面分子印迹聚合物(Fe3O4@SiO2-MIPs)o

聚合反应结束后，需通过洗脱过程去除模板分子，得到具有特异性空穴的MIPS。

常用的洗脱剂包括甲醇-乙酸混合溶液(体积比通常为9:1),利用乙酸的酸性破坏

模板分子与功能单体之间的氢键相互作用，将模板分子从聚合物中洗脱出来。洗脱

过程通常采用索氏提取法或离心洗涤法，反复洗脱多次，直至通过高效液相色谱检

测确认洗脱液中无模板分子残留为止。最后，将洗脱后的MIPS在60C。下真空干

燥，备用。

3.2分子印迹聚合物的性能表征

为评估MIPS对MCT-HbAdduct的选择性和吸附性能，需对其进行一系列性能表

征，主要包括结构表征、吸附性能表征和选择性表征等。

3.2.1结构表征

采用透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)观察MIPS的形貌和粒

径分布。通过TEM图像可清晰观察到MIPS的核壳结构，即Fe3O4磁性内核表面

包裹着层均匀的聚合物印迹层，厚度约为20-50nm;SEM图像显示MIPs具有

良好的分散性，无明显团聚现象。

采用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析MIPS的化学组成。在FT-IR光谱中，

3400cm-1左右的吸收峰对应于载体表面氨基和功能单体段基的O-H/N-H伸缩振

动；1730cm-1左右的吸收峰对应于交联剂EGDMA中酯基的C=O伸缩振动；

1600cm-1左右的吸收峰对应于模板分子中毗咯环的C=C伸缩振动。洗脱模板分

子后，1600cm-1左右的吸收峰消失，表明模板分子已成功去除，同时其他特征峰

依然存在，证明聚合物印迹层已成功制备。

采用X射线衍射(XRD)分析MIPs的晶体结构。Fe3O4@SiO2-MIPs的XRD图

谱中出现了Fe3O4的特征衍射峰(26=30.1\35.5。、43.1。、53.4。、57.0。、

62.6°),与标准卡片(JCPDSNo.19-0629)一致，表明聚合过程未改变Fe3O4

的晶体结构，MIPs仍具有良好的磁性。

3.2.2吸附性能表征

通过静态吸附实验研究MIPs对MCT-HbAdduct的吸附动力学和吸附等温线。吸

附动力学实验：将一定量的MIPs加入到不同浓度的MCT-HbAdduct标准溶液中,

在室温下振荡，分别在不同时间点取样，离心分离后，采用HPLC检测上清液中

MCT-HbAdduct的浓度，计算MIPs的吸附量。结果表明，MIPs对MCT-Hb

Adduct的吸附速率较快，在30分钟内即可达到吸附平衡，这主要归因于表面分子

印迹聚合形成的印迹层厚度较薄，传质阻力小。

吸附等温线实验：将相同质量的MIPS分别加入到一系列不同浓度的MCT-Hb

Adduct标准溶液中，在室温下振荡至吸附平衡，测定上清液中MCT-HbAdduct的

浓度，绘制吸附等温线。采用Langmuir和Freundlich吸附模型对实验数据进行拟

合，结果显示Langmui「模型的拟合度更高侬＞0.99）,表明MIPs对MCT-Hb

Adduct的吸附为单分子层吸附，且吸附位点分布均匀。通过Langmuir模型计算得

到MIPs对MCT-HbAdduct的最大吸附容量可达15.2mg/g,显著高于非印迹聚合

物（NIPs,最大吸附容量为4.8mg/g）,证明MIPs对MCT-HbAdduct具有良好

的吸附性能。

3.2.3选择性表征

通过选择性吸附实验评估MIPs对MCT-HbAdduct的特异性识别能力。选择与野

百合碱结构相似的毗咯里西咤类生物碱（如千里光碱、倒千里光碱）和血液中常见

的蛋白质（如白蛋白、免疫球蛋白G）作为干扰物质，将MIPs和NIPs分别加入

到含有MCT-HbAdduct和干扰物质的混合溶液中，振荡至吸附平衡后，测定各物

质的吸附量，计算分离因子（a）和相对选择性因子（B）。

结果显示，MIPs对MCT-HbAdduct的吸附量显著高于对干扰物质的吸附量，分

离因子a（MCT-HbAdduct/千里光碱）为5.8,a[MCT-HbAdduct/白蛋白）为

8.2;而NIPs对MCT-HbAdduct和干扰物质的吸附量无明显差异，分离因子均小

于1.5。相对选择性因子0（MIPs的a/NIPs的a）均大于3.0,表明MIPs对MCT-

HbAdduct具有优异的选择性，其原因在于MIPs中存在与MCT-HbAdduct空间

结构和官能团互补的特异性结合位点，可有效区分目标分析物与干扰物质。

4分子印迹聚合物在血液中野百合碱■血红蛋白加合物分析中

的应用

4.1样品前处理流程

基于MIPs的高选择性和吸附性能，将其作为固相萃取吸附剂，建立血液中MCT-

HbAdduct的前处理方法，具体流程如下：

4.1.1血液样品的预处理

取1mL新鲜血液样品，加入2mL去离子水稀释，再加入3mLacetonitrile（乙

睛），涡旋振荡5分钟，使血液中的蛋白质充分沉淀，4C。下离心（8000rpm,10

分钟），收集上清液。向沉淀中再次加入2mL乙月青，重复上述操作，合并两次上

清液，旋转蒸发至近干，用5mLpH=7.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶解残渣，得

到样品溶液。

4.