神经干细胞和神经细胞培养33

神经干细胞和神经细胞培养一.神经干细胞1.胎儿神经干细胞2.成体神经干细胞二.神经细胞1.神经元2.小胶质细胞3.星形胶质细胞4.少突胶质细胞三.本实验室长期培养维持的一些细胞基本设备、器械、耗材基本设备超净工作台CO2培养箱低温离心机水浴锅移液器显微镜冰箱器械剪刀镊子70µm滤器注射器耗材5ml移液管10ml移液管T25培养瓶T75培养瓶15ml离心管50ml离心管各种规格枪头60mm玻璃培养皿神经组织与其它组织最大的区别

离体缺氧的条件下，组织细胞易发生凋亡，导致后续的分离培养不易取得成功，因此成功分离获得神经组织细胞的首要条件是尽可能保证所获取的脑组织在第一时间运送至实验室并及时进行培养相关处理！一.神经干细胞

1.胎儿神经干细胞培养培养液DMEM-F12B27(1:50)bFGF(20ng/ml)EGF(20ng/ml)Heparin(5μg/ml)L-GlutaminePenicillinStreptomycin洗涤液：PBS(pH7.4)操作步骤1.胎脑组织在冰预冷的PBS中洗涤5次以上；2.用剪刀剪碎组织3.5ml注射器抽吸剪碎的组织，直至组织成匀浆状4.加入适量的培养液，5ml移液管轻轻吹吸后，用70um筛网过滤；5.收集过滤后的单细胞悬液，接种在T75培养瓶中，放入培养箱培养；6.次日显微镜下观察，应能观察到神经球；7.待大部分神经球直径达到200um左右时，酶消化传代。脑组织洗涤5次以上剪碎注射器抽吸至匀浆状加入培养液过滤收集单细胞悬液培养神经球传代用消化液：TrypleTMExpress(Invitrogen,Carlsbad,CA),加入适量的0.5%DNase注意事项1.运输过程保证低温(4度左右)无污染2.操作过程保证无污染3.动作迅速、吹吸力度适宜4.传代培养时需掌握最佳的消化时间及吹吸力度JournalofNeuroscienceMethods85(1998)141–152Anewmethodfortherapidandlongtermgrowthofhumanneuralprecursorcells.一.神经干细胞

2.成体神经干细胞培养培养液DMEM-F12B27(1:50)bFGF(20ng/ml)EGF(20ng/ml)Heparin(5μg/ml)L-GlutaminePenicillin

Streptomycin组织消化液配制Dispase2.4U/mlCollagenase1mg/mlDNase70U/mlBSA0.1%PBS定容洗涤液：PBS(pH7.4)操作步骤1.成体脑组织在冰预冷的PBS中洗涤5次以上；2.用剪刀剪碎组织（尽可能剪得较碎）；3.加入PBS离心收集剪碎的组织；4.加入适量的消化液，37度水浴消化，每隔5分钟取出吹打数次，并取少量消化液在显微镜下观察消化程度；5.消化15分钟左右，吹打数次后在超净台内静止数分钟，将上层悬液移入一离心管内，剩下未消化完全的组织继续进行消化；6.继续消化15分钟左右，重复步骤5；7.继续消化15分钟左右，重复步骤5。共计消化45分钟左右结束消化，将三次消化收集的悬液合并过滤后，离心收集细胞；8.接种在T75培养瓶中，放入培养箱培养；9.每天显微镜下观察，约10天左右应能观察到神经球；10.待大部分神经球直径达到200um左右时，酶消化传代。洗涤脑组织5次以上剪碎脑组织PBS洗涤消化15分钟静置法收集悬液继续消化15分钟继续消化15分钟过滤离心收集细胞接种培养Neurosurgery62:223–231,2008LONG-TERMEXPANSIONOFADULTHUMANBRAINSUBVENTRICULARZONEPRECURSORS.二.神经细胞

1.神经元培养液NeurobasalB27(1:50)ITS4mMAra-CPenicillin

Streptomycin5%FBS

(24hour)洗涤脑组织5次以上剪碎脑组织PBS洗涤消化15分钟静置法收集悬液继续消化15分钟继续消化15分钟过滤离心收集细胞接种至包被过的玻片培养密度梯度离心组织消化液Dispase2.4U/mlCollagenase1mg/mlDNase70U/mlBSA0.1%PBS定容NatureProtocol，2007，2：1490-1498Isolationandcultureofadultneuronsandneurospheres.培养液DMEM/F12,10%FBS二.神经细胞

2.小胶质细胞小胶质细胞分离方法1.细胞黏附法2.密度梯度离心法分离原理：相对于其它胶质细胞，小胶质细胞对培养皿塑料壁的黏附性较强。鉴定标志物：CD45，CD68等。TheInternationalJournalofBiochemistry&CellBiology42(2010)844–856Adulthumanbraincellcultureforneuroscienceresearch.二.神经细胞

3.星形胶质细胞培养液DMEM/F12,10%FBS细胞悬液未包被培养皿过夜收集未帖壁细胞包被培养皿星形胶质细胞接种至接种至分离原理：利用贴壁时间差别以及星形胶质细胞可传代培养等特点可将其分离富集。鉴定标志物：GFAP等。TheInternationalJournalofBiochemistry&CellBiology42(2010)844–856Adulthumanbraincellcultureforneuroscienceresearch.二.神经细胞

4.少突胶质细胞白质酶消化梯度离心接种培养24h收集悬浮液星形胶质细胞接种培养少突胶质细胞培养液DMEM/F12,10%FBS分离原理：在白质来源的培养物中，往往只含少突胶质细胞和星形胶质细胞，而小胶质细胞非常少。借助于少突胶质细胞不具备粘附培养皿的能力，可以将之富集。鉴定标志物：半乳糖脑苷等galactocerebroside(O1)BrainResearchProtocols52000.85–94Isolationandcharacterizationofadultmicroglialcellsandoligodendrocytesderivedfrompostmortemhumanbraintissue.三.本实验室长期培养维持的一些细胞1.人胎儿神经干细胞2.成人神经干细胞3.人胚胎干细胞4.人体细胞核移植干细胞5.人胶质瘤干细胞6.小鼠胚胎干细胞7.干细胞诱导分化的神经细胞图1原代神经球形成过程图2神经球传代培养

A:单细胞悬液种植后24h（×400）；B：原代培养后72h（×400）；C：原代培养后7d（×200）A：传代后2d（×400）；