大豆孢囊线虫检测技术规程

1大豆孢囊线虫检测技术规程1范围仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本分析实验室用水规格和试验方法植物线虫检测规范线虫标本采集分离保存规范大豆孢囊线虫soybeancystnematode4主要试剂4.4蔗糖、高岭、甘油、盐酸、无水乙醇、甲醛：分析纯25.2生物显微镜：40倍～1000倍。5.3体视显微镜：10倍～120倍。6.1样品采集6.1.1采集对象根表面附有柠檬形、白色或乳白色的雌虫(见附录A),初步诊断为疑似受大豆孢囊线虫危害，采集其a)根系样品：采集具有典型症状应置于4℃冰箱或冷藏箱中暂时保存，保存时间不宜超过7d。6.2.1二龄幼虫、雄虫和孢囊分离6.2.2标本制作6.3.1线虫DNA提取36.3.4反应程序95℃预变性5min;95℃变性1min,65℃退火1min,72℃延伸1min,35次循环；72℃延伸10min;4℃保存。6.3.5琼脂糖凝胶电泳检测取10μLPCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳(电压120V,时间35min)分离，经核酸染料染色后，7结果判定7.1形态学鉴定结果特异性条带(见附录E),则判定该样品鉴定结果为阳性，即为大豆孢囊线虫。若待测样品为阴性，即4(资料性)期植株明显矮化、瘦弱，叶片由下向上变黄，叶柄及茎顶部呈浅黄色(见图A.1)。花期延迟，花器丛此即为大豆孢囊线虫的孢囊(雌虫),这是鉴别是否有大豆孢囊线虫发生的重要特征。病株固氮根瘤明5A.2.1测量数据雄虫：长911μm~1384μm(平均为1126μm),体长/体宽32～48(39),体长/食道长度7～11(9),口针长24μm~27μm(26μm),引带长28μm～44μm(36μm)。A.2.2形态描述雌虫：柠檬形，颈部和阴门锥明显，年轻雌虫初为白色，开始产卵后变为灰黄色。随着衰老和死近200个卵。孢囊：浅至深褐色，梨形或柠檬形，有颈和突出的阴门锥，孢囊外表皮有锯齿状线条的皱纹，两6图A.3大豆孢囊线虫形态特征7B.1浅盘法分离二龄幼虫8.1.3将浅盘中的水通过500目的网筛倒出，再用弱水流冲洗将线虫混合液聚集在网筛的边上。B.2简易漂浮法分离土壤中孢囊B.2.1待分离土样风干后，充分混匀，取500g～1000g土样，放入5L塑料桶中充分搅拌2min,使孢8.2.2将桶.上层的悬浮液经过20目网筛倾倒入60目网筛，用强水流冲洗20目网筛上的残渣，收集68(资料性)将杀死后的线虫移至1倍固定液(40%甲醛，甘油，蒸馏水比例为8:2:40)中，或直接在悬浮液中加剂中，使其下沉至底部，并将其排列整齐。将3根与线虫虫体直径相近的玻C.4.1甘油-乙醇法线虫脱水在洁净的表面皿(培养皿或其他较小的玻璃皿)中，加入1mL脱水液I(96%乙醇，甘油，蒸馏水比例为20:1:79),将固定好的线虫挑入其中，在干燥器内注入96%乙醇至容积1/10左右。将该皿置于干燥器内，盖上干燥器盖。干燥器置于35℃~40℃恒温箱内保持12h以上。将表面皿上层液体吸出，加满脱水液II(96%乙醇，甘油比例为95:5),继续置于恒温箱内保温3h以上，使乙醇慢慢蒸发，直至线大量材料制片可采用简易方法，在表面皿(也可用培养皿或其他较小的玻璃皿)中C.4.2.1蜡环封固制片片中央，冷却后形成一蜡环，在蜡环中滴一小滴纯甘油(与脱水后线虫后不外溢为宜，尽量避免产生气泡),挑入数条固定的线虫沉入甘油底部排列整齐后，选取3根与线虫虫体直径相近的玻璃纤维丝呈三角状均匀排列在甘油的边缘，将载玻片转移至65℃~70℃加热板融化石蜡。融化后移至平面上冷却，用指甲油(也可用中性树胶或阿拉伯树胶)封片，指甲油干后再重复封9C.4.2.2孢囊线虫阴门锥制片孢囊用水浸泡24h后，挑取单个孢囊转移至载玻片一侧的水滴中，在体移至载玻片另一侧的70%、95%和100%的乙醇中脱水，将脱水后的阴门锥转移至丁香油中透明，然后(资料性)D.1在体视显微镜下挑取1个饱满的孢囊或单头2龄幼虫放入装有10μL灭菌双蒸水的0.2mLPCRD.2取出后置于冰上，用消毒的玻璃棒在PCR管中快速将孢囊或二龄幼虫研磨碎。h,取出后置于冰上缓慢解冻(约10min～15min),避免快速解冻导致DNA降解。D.6取上清DNA悬浮液于-20℃保存备用。(资料性)大豆孢囊