病毒感染的诊断与防治课件

病毒感染的診斷與防治

常用的病毒學診斷方法包括：病毒的分離鑒定病毒的血清學檢查病毒蛋白和核酸的檢測第一節病毒感染的診斷一、標本的採取與送檢應注意下列原則：1.對本身帶有雜菌(如咽拭子、糞便)或易受污染的標本，要進行病毒分離培養時，應使用抗生素。2.因病毒在室溫中易失去活性，標本應低溫保存並儘快送檢。3.血清學診斷標本的採取應在發病初期和病後2～3w內各取1份血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態變化。二、病毒的分離與鑒定(一)病毒的分離1.動物接種是最原始的病毒培養方法，根據病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜神經性病毒（狂犬病毒）可接種於小鼠腦內，痘病毒可接種於家兔角膜或皮內。

2.雞胚培養雞胚對多種病毒敏感。一般採用孵化9～14天的雞胚，根據病毒種類不同，將病毒標本接種於雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。3.組織培養法(tissueculture)或細胞培養(cellculture)法是將離體活組織塊或分散的組織細胞加以培養的技術總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。細胞的變化有些病毒在細胞內增殖時可引起特有的細胞病變，稱為細胞病變效應(CPE)。常見的變化有細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等作用於細胞膜，可使鄰近的細胞相互融合，形成多核巨細胞或稱融合細胞。有些病毒(如狂犬病病毒、麻疹病毒等)可在培養細胞中形成胞漿或核內的包涵體。病毒在培養細胞中增殖的指標病毒培養時出現的CPE2.紅細胞吸附(hemadsorption,HAd)流感或副流感病毒等感染細胞後，由於細胞膜上出現了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎動物(豚鼠、雞、猴等)紅細胞的能力，這一現象稱紅細胞吸附，常用來測定具有HA的粘病毒與副粘病毒的增殖。若有相應的抗血清，則能中和細胞膜上的HA，HAd不再發生，稱紅細胞吸附抑制試驗。3.干擾現象(interference)某些病毒感染細胞時不出現CPE或其他易於測出的變化(如HAd)，但能幹擾在其後感染的另一病毒的增殖。如風疹病毒感染Vero細胞時CPE不明顯，但它能幹擾後感染的埃可病毒(ECHOV)的增殖，從而阻抑後者所特有的CPE。4.細胞代謝的改變病毒感染細胞的結果可使培養液的pH值改變，說明細胞的代謝在病毒感染後發生了變化。這種培養環境的生化改變也可作為判斷病毒增殖的指標。(二)病毒的數量與感染性測定

1.蝕斑測定是一種檢查和準確滴定病毒感染性的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細胞培養瓶中。病毒吸附後，再覆蓋一層融化的半固體營養瓊脂，使病毒在單層細胞培養中有限擴散。結果是每一個有感染性的病毒在單層細胞中可產生一個局限性的感染灶。用活性染料(如中性紅)染色，則活細胞著色，受病毒感染而破壞的細胞不著色，形成肉眼可見的蝕斑(plaque)。每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作蝕斑形成單位(plaqueformingunit,PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFU／ml表示。2.50%組織細胞感染量(TCID50)測定法該方法是測定病毒能使50%的組織培養細胞發生感染的最小量。一般是將病毒懸液作10倍的系列稀釋，分別接種細胞，經一定時間後觀察CPE、血細胞吸附等指標，以最高稀釋度能感染50%細胞的量為終點。最後用統計方法計算出50%組織細胞感染量（50%tissuecultureinfectiousdose,TCID50)。三、病毒感染的血清學診斷原理是用已知病毒抗原來檢測病人血清中有無相應抗體，故須待病人感染後體內產生抗體時才能檢出。另外，在採取臨床標本及病人血清應注意病程，必須採取患者急性期血清與恢復期血清(雙份血清)進行血清學試驗。若第2次血清抗體滴度比第1次高出4倍以上時，才有診斷意義。1.中和試驗(neutralizingtest,NTtest)

是病毒在活體內或細胞培養中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗。中和抗體(netralizing

antibodies,NTAb)是作用於病毒表面抗原(衣殼或包膜)的抗體，同種不同型病毒間一般無交叉，特異性高，而且抗體在體內維持時間長。中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也可能因以前有過隱性感染所致。因此，中和試驗適用於人群免疫情況的調查，在臨床診斷上較少使用。2.補體結合試驗

(complementfixationtest,CFtest)用已知病毒可溶性(CF)抗原來檢測病人血清中相應(CF)抗體。CF抗原是病毒的內部抗原，同種異型間常有交叉，故特異性較中和試驗低。但CF抗體出現較早，消失較快，故CF陽性可作為近期感染的指標。3.血凝抑制試驗(hemagglutinatiainhibitiontest,HItest)

具有HA的病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞，稱血凝現象。這種現象能被相應抗體抑制，稱HI試驗。其原理是相應抗體與病毒結合後，阻抑了病毒表面的HA與紅細胞的結合。本試驗簡易、經濟，特異性高，常用於粘病毒及乙型腦炎病毒感染的輔助診斷及流行病學調查，也可鑒定病毒的型與亞型。病毒+雞RBC=凝集（血凝試驗）病毒+特異性抗體+雞RBC=不凝集（血凝抑制試驗）四、病毒感染的快速診斷

快速診斷主要是指從含有病毒標本及感染機體的血清中檢測病毒顆粒、蛋白抗原、IgM抗體和核酸等，往往在數小時內即可得出結果。(一)形態學檢查1.電鏡和免疫電鏡檢查2.普通光學顯微鏡檢查有些病毒在宿主細胞內增殖後，在細胞的一定部位(胞核、胞漿或兩者兼有)出現一個或數個、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜鹼性的結構，即包涵體。包涵體對病毒感染的診斷有一定價值。(二)病毒蛋白抗原檢查

用螢光素、放射性同位素、過氧化物酶等標記抗體，採用免疫學和分子生物學技術，檢測標本中的病毒蛋白抗原，具有敏感、特異、快速等優點。1.免疫螢光技術(immunofluorescence,IF)2.固相放射免疫測定(solid-phaseradioimmunoassay,SPRIA)3.酶免疫技術(enzymeimmunoassay,EIA)此法可檢測多種病毒及其抗體，主要是酶免疫組化法和酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)。(三)特異性IgM抗體的檢測

檢測病毒特異性IgM抗體可診斷急性感染，特別是對證實孕婦感染風疹病毒尤為重要，但應注意類風濕因數(IgM)的干擾。另外，檢測早期抗原的抗體是快速診斷的另一途徑。如檢測針對EBV的早期抗原(EA)、核心抗原(EANA)和衣殼抗原(VCA)等的抗體，可以區別急性或慢性EBV感染。此外，分子生物學檢測技術、氣相色譜技術等，均可用來分析和鑒定病毒感染。(四)檢測病毒核酸

1.核酸雜交技術用於病毒檢測的有斑點雜交、細胞內原位雜交、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交等。2.核酸擴增法目前多數病毒基因已通過分子克隆技術被明確了核苷酸序列，使得DNA擴增技術逐步發展為常規診斷技術之一。3.基因晶片技術基因晶片又稱DNA晶片、生物晶片（biochip）。其原理是：將已知的生物分子探針或基因探針，大規模或有序排布於小塊矽片等載體上，與待測樣品中的生物分子或基因序列相互作用和並行反應，在鐳射的激發下，產生的螢光譜信號被接受器收集，電腦自動分析處理數據並報告結果。其優點是：可以一次性完成大量樣品DNA序列的檢測和分析，解決了傳統核酸雜交技術的許多不足。晶片技術在病毒等微生物學診斷和流行病學調查方面有著廣闊的應用前景。第二節病毒感染的預防一、人工自動免疫(一)活疫苗(attenuatedvaccine,orlivingvaccine)1.常規活疫苗即減毒活疫苗(attenuatedvaccine)，通常是用自然或人工選擇法(如溫度敏感株)篩選的對人低毒或無毒的變異株製成的疫苗，如脊髓灰質炎、流感、麻疹的減毒活疫苗等。2.新型活疫苗應用基因工程技術，控制病毒變異，或利用DNA重組技術，插入和定向缺失病毒基因，將保護性病毒蛋白的編碼基因插入活載體中或選擇性地去除病毒的某一個或幾個致病基因而達到減毒作用製備的可在機體內增殖，誘發抗病毒免疫應答的疫苗。(二)死疫苗(killedvaccine)1.滅活全病毒疫苗應用物理或化學方法使病毒完全滅活而製成的疫苗。常用的有乙型腦炎、狂犬病、流感等滅活疫苗。2.亞單位疫苗(subunitvaccine)製備不含有病毒核酸、僅含有能誘發中和抗體的病毒衣殼蛋白或包膜表面抗原，是最理想的疫苗。3.合成肽病毒疫苗(synthesizedpeptideviralvaccine)人工合成與病毒保護性抗原決定簇的氨基酸序列相同的肽段，製備成免疫原後免疫動物或人體，使機體產生保護性抗體4.基因工程疫苗(geneengineringvaccine)利用基因工程技術，分離、重組、轉化和表達基因，製備出的能引起人體保護性免疫應答疫苗。5.DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗，這種核酸分子是一種細菌的質粒，在克隆了特異性的基因以後，能在真核細胞中表達蛋白質抗原，刺激機體產生特異性體液和細胞免疫。6.新型多價聯合疫苗、口服疫苗的研究減毒活疫苗與死疫苗優缺點比較特點減毒活疫苗死疫苗製備方法通過非正常培養減毒株通過化學物理方法使感染失活免疫接種一般為一次性多次免疫疫苗的穩定性相對不穩定相對穩定免疫的類型體液免疫和細胞免疫體液免疫毒力回升有可能不可能安全性對免疫缺陷者有危險安全性好生產和成本生產較複雜、成本高生產簡單、成本低二、人工被動免疫人工被動免疫的製劑有免疫血清和丙種球蛋白，或與細胞免疫有關的因數等。大多數人均受過不同種類的病毒感染，從正常血清中提取免疫球蛋白可用於緊急預防。常注射人免疫球蛋白預防甲型肝炎、麻疹、脊髓灰質炎等。可使接觸病原者不出現症狀或僅出現輕微症狀。近年來有人應用含有高滴度抗HBs的乙肝免疫球蛋白Ig)預防乙型肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白時因其半衰期短，故應注意有效期。第三節病毒感染的治療一、抗病化學製劑（一）核苷類藥物核苷類藥物的作用機制有主要是抑制病毒基因複製①模擬核苷成分摻入病毒基因組：合成的異常嘧啶取代病毒DNA前體的胸腺嘧啶，病毒在複製過程中，這種異常的嘧啶分子摻入子代DNA中使子代病毒結構基因的合成和表達無法進行，從而抑制病毒的複製，或複製出的病毒為缺陷病毒。②競爭病毒複製酶

1.無環鳥苷(acyclovir,ACV，阿昔洛韋)和丙氧鳥苷（ganciclovirGCV，庚昔洛韋）為鳥嘌呤或去氧鳥嘌呤核苷類似物。該藥細胞毒性很小，是目前最有效的抗皰疹病毒藥物之一。廣泛用於皰疹病毒感染引起的單純皰疹、生殖器皰疹及帶狀皰疹。2.疊氮胸苷(azidothymidine,AZT)胸腺嘧啶核苷類似物，通過阻斷前病毒DNA的合成而抑制HIV的複製，AZT對病毒逆轉錄酶的抑制比對細胞DNA多聚酶敏感100倍以上。可以有效地降低AIDS的發病率與病死率。耐藥株的出現系由基因突變導致逆轉錄酶具有耐藥性。因有抑制骨髓作用和形成病毒的耐藥而面臨被淘汰。3.病毒唑對多種RNA和DNA病毒的複製都有抑制作用，但主要用於RNA病毒感染的治療，對細胞的核酸也有抑制作用。目前臨床主要用於流感病毒和呼吸道合胞病毒的治療。（二）病毒基因轉錄抑制劑這類核苷衍生物模擬天然二去氧核苷底物，經一系列磷酸化成為5’-三磷酸後，作為相似的底物競爭性抑制病毒逆轉錄酶活性。被磷酸化的藥物分子與核苷酸分子相似，在RNA範本合成DNA過程中被嵌入DNA中。此DNA再轉錄時，由於其中的藥物分子不是正常的核苷酸，因而轉錄酶不能識別，從而使轉錄受阻。（三）非核苷類逆轉錄酶抑制劑①nevirapine

第1個新合成的非核苷類逆轉錄酶抑制劑。1996年獲准用於治療HIV，耐藥株已出現，故建議與其它藥聯合使用；②pyridone

作用類似nevirapine.（四）蛋白酶抑制劑1．賽科納瓦(saquinavir)1995年批准的第1個蛋白酶抑制劑。2．英迪納瓦（indinavir）、瑞托納瓦（ritonavir）是1996年批准的新一代蛋白酶抑制劑，用於HIV。（五）其他抗病毒藥物1.金剛烷胺和甲基金剛烷胺金剛烷胺為合成胺類，甲基金剛烷胺是其衍生物，兩者有相同的抗病毒譜和副作用，能阻止脫殼，主要用於治療甲型流感。2.甲酸磷黴素無機焦磷酸鹽的有機類似物，抑制多種皰疹病毒，包括CMV、HSV、VZV、EBV、HHV6，可能還對HBV和逆轉錄病毒有作用。選擇性抑制病毒DNA多聚酶和逆轉錄酶，而對宿主細胞無影響。二、干擾素和干擾素誘生劑的應用1.干擾素(IFN)具有廣譜抗病毒作用，毒性小，使用同種IFN無抗原性，主要用於甲、乙、丙型肝炎，HSV