食品科学与工程类实验综合指导 课件 第二章 微生物学实验

第二章

微生物学实验目录01细菌和放线菌形态特征观察02微生物大小的测量与直接计数法04培养基的配制及灭菌06微生物生理生化鉴定03酵母菌菌落特征、霉菌个体和菌落特征观察05微生物的接种、分离、纯化和培养目录07血清学反应08食品中菌落总数的测定10食品中金黄色葡萄球菌的定性检验12特定细菌基因的扩增、测序与分析09MPN法测定食品中的大肠菌群数11泡菜中乳酸菌的分离、鉴定与表征细菌和放线菌形态特征观察01一、实验目的掌握细菌革兰氏染色法的原理及操作步骤，学会在油镜下观察细菌个体形态；学会观察并描述细菌菌落的形态特征；学习放线菌的形态观察方法，辨认放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝及孢子形态。二、实验概述革兰氏染色原理：1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。主要由于两类细菌的细胞壁成分和结构不同二、实验概述细菌菌落特征：细菌个体形态及菌落特征是辨认、鉴定菌种的重要依据。放线菌菌落特征：和细菌的简单染色一样，放线菌可用乳酸酚棉兰液、石炭酸复红或吕氏碱性美蓝染料着色后，在显微镜下观察其形态。细菌的隆起、边缘和表面特征典型放线菌菌落三、实验材料与设备主要实验材料1.菌种：

细菌：大肠杆菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），观察菌落、革兰氏染色用；

放线菌：灰色链霉菌（Streaptomycesgriseus），盖玻片平板插片培养4-7天，用于放线菌形态观察。2.染色液和试剂：草酸铵结晶紫染色液、碘液、95%乙醇、0.5%番红染色液、乳酸酚棉兰液主要实验设备

接种环、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、镊子、显微镜等。四、实验案例1:细菌个体和菌落形态特征观察4.1实验流程（细菌革兰氏染色）涂片：取洁净载玻片一张，在火焰上微微加热，冷却；在中央部位滴加一小滴无菌生理盐水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体；干燥：涂布后，待其自然干燥；固定：将已干燥好的涂片标本向上，在微火上通过3～4次进行固定。四、实验案例1:细菌个体和菌落形态特征观察4.2实验设计（细菌革兰氏染色）染色：包括初染、媒染、脱色及复染

①初染：将载玻片置于搁架上，加草酸铵结晶紫染色液盖满菌膜，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心冲洗（水洗时水流不要直接冲洗涂面，以免水流过大将菌体冲掉）。

②媒染：滴加碘液，染色1-2min，水洗。

③脱色：滴加95%乙醇，脱色15-25s左右立即水洗，以终止脱色，但脱色时间要控制好，以免脱色时间过长，影响结果判断。

④复染：滴加番红染液，染色2-3min，水洗后晾干（不可擦干）。镜检：干燥后，置于显微镜下进行观察，在油镜下观察到被染成紫色者即为革兰氏阳性细菌（G+），被染成红色者即为革兰氏阴性细菌（G-）。四、实验案例1:细菌个体和菌落形态特征观察（1）载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄；（2）革兰氏染色成败的关键是酒精脱色；（3）染色过程中勿使染色液干涸；（4）选用幼龄的细菌。4.2实验设计（细菌革兰氏染色）四、实验案例1:细菌个体和菌落形态特征观察4.3实验设计—细菌菌落形态特征观察大小：具体使用尺子度量或估计，一般用mm表示；形状：正面—圆形、阿米巴状、菌丝体状、圆酵母状、不规则状、丝状、卷发状、假根状；侧面—扩展（扁平）、低凸面、台状、凸面、乳头状、褶皱凸面、中凹台状、凸脐状、复轮状；边缘：整齐、缺刻、圆锯齿形、波状、裂叶状、有缘毛、镶边、深裂形、多枝形；表面：湿润、光滑、干燥、粗糙、绉褶。颜色：菌落本身的颜色和分泌的可溶性色素。透明度：不透明、半透明、透明。四、实验案例1:细菌个体和菌落形态特征观察4.4结果与分析做好相关实验结果记录，填好相应表格；绘出枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的形态图；注明两菌的革兰氏染色的反应性。枯草芽孢杆菌（革兰氏染色）大肠杆菌（革兰氏染色）四、实验案例1:细菌个体和菌落形态特征观察4.4结果与分析细菌菌落形态观察描述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌菌落特征（包括大小、色泽、透明度、边缘和表面隆起等）。菌名菌落特征大小(mm)形状边缘表面颜色透明度正面侧面

四、实验案例2:放线菌菌落形态特征观察4.1实验设计—放线菌菌落形态特征观察接种、插片及培养：可用两种方法接菌：a先接种后插片：冷凝后用接种环挑取少量斜面上的放线菌孢子，用平板培养基的一半面积作来回划线接种。b先插片后接种：用平板培养基的另一半面积进行；制片：用无菌镊子取无菌盖玻片，在已接种平板上以45°角斜插入培养基内。同时，在另一半未经接种的部位以同样方式插入数块盖玻片，然后接种少量放线菌孢子至盖玻片一侧的基部。培养结束，放置在显微镜下观察；镜检。4.2操作要点（1）先接种后插片：冷凝后用接种环挑取少量斜面上的放线菌孢子，用平板培养基的一半面积作来回划线接种（接种量可适当加大）；（2）选取菌体较多部位的盖玻片，便于观察各种菌丝形态；（3）镜检先用低倍镜、后用高倍镜观察。；（4）注意菌丝细胞的大小，有无分隔，孢子丝的形状，孢子的形状和大小。四、实验案例2:放线菌个体和菌落形态特征观察4.3结果与分析观察放线菌的菌落特征，绘制放线菌的镜检结果，并在镜检图上标注各部分结构名称。四、实验案例2:放线菌菌落形态特征观察五、思考题要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些操作?哪一步是关键步骤?为什么?当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠?比较细菌和放线菌的主要区别，两者最主要的鉴别特征是什么?

微生物大小的测量与直接计数法02一、实验目的学习显微镜下测量微生物大小的基本方法，掌握接目测微尺和接物测微尺的校准与使用；学习血球计数板计数法的原理与方法，学会区别死活酵母细胞并进行计数。二、实验概述微生物大小的测量：微生物细胞的大小，是区别微生物的重要形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有接目测微尺和接物测微尺。微生物直接计数法：微生物数量测定方法很多，通常有显微镜直接计数法、平板计数法、细胞和原生质体总量计测法等。镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板。二、实验概述血球计数板结构示意图三、实验材料与设备主要实验材料1.菌种：

啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）悬浮液。2.染色液和试剂：美蓝染液、无菌水主要实验设备

血球计数板、酒精灯、接种环、盖玻片、计数器、普通光学显微镜、接目测微尺、接物测微尺。四、实验案例4.1实验流程4.2操作要点（1）切换物镜时，需要重新对接目测微尺进行标定。测量菌体大小时，需在同一视野内测量多次，取平均值以提高准确性；（2）染色时，美蓝染液需避光保存，以免影响染色效果；（3）由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏；（4）如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差；（5）凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算；（6）实验结束后，血球计数板需彻底清洗，并避免碰撞以免损坏刻度。四、实验案例4.3实验设计接目测微尺的标定：目镜测微尺每小格代表长度（μm）酵母细胞大小测定：制备酵母水封片→显微镜观察酵母水封片（10x、40x）；镜检计数室：若有污物，则需清洗后才能进行计数；稀释：取1mL酵母菌培养液，加入成倍的无菌水稀释，稀释n倍后，再用血球计数板计数，所得数值乘以稀释倍数。加样品：将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的酵母菌悬液。显微镜计数：每个样品重复计数两次。清洗血球计数板。四、实验案例4.4结果与分析四、实验案例（1）接目测微尺的标定（2）菌体大小的测量（3）酵母菌数量的测定物

镜物镜倍数接目测微尺格数接物测微尺格数接目测微尺每格长度（μm）低倍镜

高倍镜

菌种名称长度（格）宽度（格）实际大小（μm）（长×宽）

计数次数各中格内的菌数五个中格内的总菌数平均数（个/mL）%12345总菌活菌死菌活菌死菌上计数室总菌

活菌

死菌

下计数室总菌

活菌

死菌

五、思考题测量菌体大小的意义是什么?血球计数板产生误差的主要原因在哪里?如何减少误差?采用血球计数板计数和平板菌落计数的主要差异在哪里?

酵母菌菌落特征、霉菌个体和菌落特征观察03一、实验目的观察酵母菌的形态与结构及其菌落特征，掌握酵母菌的基本识别方法；学习观察霉菌形态特征的方法，掌握霉菌个体和菌落特征的鉴别要点。二、实验概述霉菌的菌落形态：霉菌的菌落大而疏松，菌落表面往往呈现不同的结构与色泽。有的菌产生可溶性色素使菌落背面呈现不同的颜色。霉菌的个体形态结构、繁殖方式、菌落特征是鉴别霉菌的主要依据。霉菌的构造：霉菌是丝状真菌的统称，营养体的基本单位是菌丝。菌丝体分为营养菌丝体和气生菌丝体。营养菌丝体可以特化为假根、附着胞等结构，气生菌丝体主要特化为各种形态的子实体，如分生孢子头、孢子囊、担子、子囊果等。子实体里面或上面可产无性或有性孢子。三、实验材料与设备主要实验材料1.菌种：

酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、红酵母（Rhodotorulasp.）、根霉（Rhizopussp.）、青霉（Penicilliumsp.）、曲霉（Aspergillussp.）。2.染色液和试剂：乳酸酚棉蓝染色液主要实验设备

镊子、载玻片、盖玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、普通光学显微镜。四、实验案例1：酵母菌和霉菌菌落特征观察4.1实验设计—酵母菌菌落特征观察观察平板上酵母菌的菌落特征性状大小颜色光泽质地表面边缘情况4.2实验设计—霉菌菌落形态观察观察霉菌菌落，并根据下列要求对每种霉菌的菌落特征加以描述。菌落的大小：局限生长或蔓延生长，菌落的直径和密度。菌落的颜色：正面（孢子和孢子丝）和背面（基内菌丝）的颜色，培养基的颜色变化。菌落的组织状态：棉絮状、蛛网状、疏松或紧密、同心轮纹、放线状的皱褶等。四、实验案例1：酵母菌和霉菌菌落特征观察4.3结果与分析记录酵母菌的菌落特征，曲霉、根霉、青霉的菌落特征。四、实验案例1：酵母菌和霉菌菌落特征观察四、实验案例2：霉菌个体形态观察4.1实验设计—霉菌个体形态观察制片：在清洁的载玻片上加一滴乳酸酚棉蓝染色液，挑取少许菌丝体，放入玻片上的乳酸酚棉蓝染色液中，使菌丝在液中展开，加上盖玻片。分别用低倍镜和高倍镜观察。根霉的识别；青霉的识别；曲霉的识别。4.2结果与分析记录曲霉、根霉、青霉的个体形态。四、实验案例2：霉菌个体形态观察菌种霉菌个体形态特征有无横隔孢子形状其他特征根霉

青霉

曲霉

五、思考题列表比较酵母菌和细菌的区别?比较放线菌和霉菌的区别，二者的主要鉴别特征是什么?

培养基的配制及灭菌04一、实验目的了解不同培养基的种类、用途及适用范围；学习培养基配制的基本原则和制作方法；掌握常用灭菌技术（高压蒸汽灭菌和干热灭菌）的操作步骤。二、实验概述培养基：是指由人工配制的，适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物所需要的六大营养要素，即碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子和水。三、实验材料与设备主要实验材料1.试剂：

蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、蔗糖、乳糖、柠檬酸铁铵、尿素、硫代硫酸钠、KH2PO4、(NH4)2HPO4、NaCl、KNO3、0.4%溴甲酚紫、0.02%酚红、1%溴麝香草酚蓝、1mol/LHCl、1mol/LNaOH。

主要实验设备

纱布、试管、搪瓷缸、烧杯、三角烧瓶、牛皮纸、棉绳、培养皿、移液管、白报纸、玻棒、pH试纸、Durham小管（倒置发酵管）、高压蒸汽灭菌锅、隔水式电热恒温培养箱、电子天平、电热干燥箱、电磁炉等。四、实验案例4.1实验流程配方-试剂-计算—称量—调配—调pH—加指示剂—过滤--分装—加塞—包扎—灭菌常见培养基配制操作步骤及流程注意：做好标记！！！四、实验案例4.2实验设计计算与称量：按照培养基的配方，依次准确地称取各种物质并记录；配调：将称量好的各种物质根据要求先后放入水中，搅拌，加热使其溶解；调pH：一般用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节培养基的pH到所要求的范围，分次少量加入酸/碱，避免过量；加指示剂；分装、加塞、标记、包扎；灭菌：最常用的是高压蒸汽灭菌法，培养基灭菌时的温度和灭菌时间，按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分；鉴定、保存：可存放于冰箱（4℃左右）内或暗凉处清洁的柜内。四、实验案例4.3操作要点（1）培养基配制过程中，计算添加量时应注意所用试剂是否带结晶水；（2）先调节培养基pH，再加对应的指示剂；（3）灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升；（4）灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防止包纸烘焦。五、思考题本实验所配制的培养基分属哪一类培养基，为什么?培养基配好后，是否应立即灭菌?为什么?为什么高压蒸汽灭菌的效率高于干热灭菌？在高压蒸汽灭菌过程中，如何确保冷空气完全排出？灭菌后的培养基若出现沉淀或分层现象，可能的原因是什么？用电热干燥箱灭菌，何时可打开烘箱门?为什么?微生物的接种、分离、纯化和培养05一、实验目的掌握无菌操作的基本技术与微生物接种方法；学习并掌握微生物的分离和纯化的原理及常用的方法。二、实验概述无菌操作:环境：台面光滑水平，关闭门窗，消毒空气，减少杂菌。操作：接种工具须干热/火焰灭菌；打开培养皿时间尽量短。微生物的分离与纯化:原理：利用目标菌对营养、pH、氧气等的特殊要求，或添加抑制剂，创造选择性培养条件。常用方法：稀释涂布平板法、稀释混合平板法、平板划线分离法。纯化后接种方式：斜面划线、液体移液、点植、穿刺等，视用途而定三、实验材料与设备主要实验材料1.菌种

大肠杆菌(Escherichiacoli)（斜面）、沙门氏菌(Salmonellasp.)（斜面）

2.培养基

葡萄糖发酵液体培养基、乳糖发酵液体培养基、柠檬酸盐斜面培养基、SIM半固体培养基、营养琼脂培养基3.材料

接种环、接种针、培养皿、酒精灯、涂布棒主要实验设备

恒温培养箱。四、实验案例4.1操作要点（1）在平板划线法中，每次都需将接种环上的剩余物烧掉。（2）使用接种环或接种针时，深入试管的部分都要灼烧灭菌。（3）穿刺接种时，接种针应原路返回。（4）实验废弃物需高压灭菌处理。（5）划线接种时，在酒精灯周围操作（45°锥形角）；深入试管部分都要灼烧灭菌；接种环先在培养基部分冷却，再挑菌；每次划线结束，先灼烧接种环，再下次划线；不要划破培养基（6）穿刺接种时，在酒精灯周围操作（45°锥形角）；接种环深入试管的部分都要灼烧灭菌；使用接种针时，要垂直插入，垂直拔出（原路返回）。四、实验案例4.2实验设计（1）

三点接种：在研究霉菌形态时常用此法（2）

倾注接种：该法是将待接的微生物先放入培养皿中,然后再倒入冷却至45℃左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀。待平板凝固之后,置合适温度下培养,就可长出单个的微生物菌落。（3）涂布接种：先倒好平板,让其凝固，将菌液倒入平板上面,迅速用涂布棒在表面作来回左右涂布,让菌液均匀分布,就可长出单个微生物的菌落。四、实验案例4.2实验设计（4）划线接种：最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动,就可达到接种的作用。常用工具有接种环、接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。伴随划线过程，菌量逐渐稀释、减少，最终得到单菌落灼烧接种环！！！培养示例平板划线分离2134微生物的纯化四、实验案例4.2实验设计（4）划线接种-斜面四、实验案例4.2实验设计（5）穿刺接种：在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时,用的接种工具是接种针。培养基一般是半固体培养基。它的做法是:用接种针蘸取少量的菌种,沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺,如某细菌具有鞭毛而能运动,则在穿刺线周围能够生长。四、实验案例4.2实验设计（6）液体接种：从固体培养基中将菌洗下,倒入液体培养基中,或者从液体培养物中,用移液管将菌液接至液体培养基中,或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中,都可称为液体接种。四、实验案例4.3结果与分析1.在本实验的三种培养基平板上长出的菌落分属于哪个类群?简述它们的菌落形态特征。2.绘制划线分离结果的草图。菌名：菌名：五、思考题1.为什么要将培养皿倒置培养?2.列表比较各种接种方法的特点和用途。3.在微生物实验中除了要注意培养基的条件外，还有哪些条件需要重视?微生物生理生化鉴定06一、实验目的掌握细菌对碳源（糖类、柠檬酸盐）和氮源（氨基酸、硝酸盐）代谢的生化反应特征。学习通过生化反应（吲哚试验、硫化氢试验、过氧化氢酶试验等）鉴别不同细菌的原理与方法。二、实验概述不同微生物因酶系差异，对含碳/含氮化合物的分解利用能力、代谢途径及产物各不相同——这是菌种鉴定的重要依据。1.糖醇类发酵实验：不同细菌对糖/醇分解能力不同（产酸产气/产酸不产气/不分解）指示：溴甲酚紫（pH＜5变黄→阳性；pH＞7为紫色）2.柠檬酸盐利用实验：能否以柠檬酸钠为唯一碳源指示：溴麝香草酚蓝（绿色→深蓝色为阳性）3.过氧化氢酶实验：有氧菌呼吸产生H₂O₂，过氧化氢酶将其分解为H₂O和O₂现象：出现气泡为阳性4.吲哚（靛基质）试验：分解蛋白胨中色氨酸产生吲哚现象：与对二甲基氨基苯甲醛结合→玫瑰红色为阳性5.硫化氢试验：分解含硫氨基酸产生H₂S现象：与铅盐/铁盐反应→黑色沉淀为阳性（穿刺接种，观察底部）三、实验材料与设备主要实验材料大肠杆菌（Escherichiacoli）、沙门氏菌（Salmonellasp.）、葡萄糖发酵液体培养基、乳糖发酵液体培养基、柠檬酸盐斜面培养基、SIM半固体培养基、营养琼脂培养基、接种环、酒精灯、试管架、杜氏小管、记号笔、载玻片、3%H2O2溶液、Kovac试剂（吲哚试剂）主要实训设备恒温培养箱。四、实验案例1：糖类发酵实验4.1实验流程四、实验案例1：糖类发酵实验4.2实验设计（1）接种：以无菌操作将大肠杆菌和沙门氏菌分别接入葡萄糖和乳糖两种液体发酵培养基中，并各留一支不接种作空白对照。（2）培养：37℃培养48h。（3）观察结果：注意培养基颜色是否变黄、杜氏小管中是否产气等变化。四、实验案例2：柠檬酸盐利用试验4.1实验流程四、实验案例2：柠檬酸盐利用试验4.2实验设计（1）接种：以无菌操作将大肠杆菌和沙门氏菌分别接入柠檬酸盐斜面培养基上，留一支管不接菌作为空白对照。（2）培养：37℃培养24～48h。（3）观察结果：取出后看有无生长，及培养基是否变为蓝色，呈蓝色者为阳性反应。四、实验案例3：过氧化氢酶试验4.1实验流程四、实验案例3：过氧化氢酶试验4.2实验设计（1）将大肠杆菌和沙门氏菌接种于合适的培养基斜面上，室温培养18～24h。（2）取一干净的载玻片，在上面滴一滴体积分数为3%的H2O2溶液，挑取斜面菌落，在H2O2溶液中涂抹，若产生气泡（氧气）为过氧化氢酶阳性反应，不产生气泡的为阴性反应。也可以直接将H2O2溶液滴加到菌落表面，观察是否有气泡产生。注意：用于培养细菌的培养基不能含有血红素或红细胞，因为它们会促使H2O2分解，产生假阳性反应。四、实验案例4：吲哚（靛基质）试验4.1实验流程四、实验案例4：吲哚（靛基质）试验4.3实验设计（1）接种：将大肠杆菌和沙门氏菌分别接入SIM半固体培养基中，留一支培养基不接菌作为对照。（2）培养：37℃培养48h。（3）观察结果：取出培养管，每管均沿管壁慢慢加入吲哚试剂5-10滴不可摇动，静置10min后，观察两液面接触处有无红色出现，若有红色出现则为阳性反应，没有红色出现则为阴性反应。四、实验案例5：硫化氢试验4.1实验流程四、实验案例5：硫化氢试验4.2实验设计（1）接种：用穿刺接种法将大肠杆菌和沙门氏菌分别接入SIM半固体培养基试管中，留一支管不接菌作对照。（2）培养：37℃培养48h。（3）观察结果：穿刺线变黑者为阳性反应。四、实验案例6：运动性试验4.1实验流程四、实验案例6：运动性试验4.2实验设计（1）接种：用穿刺接种法将大肠杆菌和沙门氏菌分别接入SIM半固体培养基试管中，垂直插入，垂直拔出，留一支管不接菌作对照。（2）培养：37℃培养48h。（3）观察结果：菌种沿穿刺线扩展生长为阳性反应。四、实验案例结果与分析观察并记录实验结果，完成下表。注：糖发酵实验中用“＋”表示产酸，“⊕”表示产酸产气，“－”表示不产酸不产气；其它实验结果中用“＋”代表阳性反应，“－”表示阴性反应，“±”表示结果不确定或不明显。注：“＋”代表阳性反应，“－”表示阴性反应，“±”表示结果不确定或不明显。试验内容培养条件大肠杆菌沙门氏菌有无生长结果有无生长结果葡萄糖发酵

乳糖发酵

柠檬酸盐利用

试验内容大肠杆菌沙门氏菌过氧化氢酶

吲哚

H2S

运动性

五、思考题1.解释所做生化试验的反应原理?2.在微生物的生化实验中，微生物的接种后的培养时间对结果有何影响?3.试述微生物对含碳化合物、含氮化合物的分解利用在细菌鉴定中的作用。4.为何沙门氏菌能在柠檬酸盐培养基中生长而大肠杆菌不能？

血清学反应07一、实验目的

掌握血清学反应的原理，理解在细菌鉴定中的应用。

学习玻片凝集法，了解抗原与抗体结合的特异性，对凝集反应和沉淀反应有初步认识。二、实验概述抗原（Ag）是能刺激机体产生抗体并与其发生特异性反应的物质；抗体（Ab）是抗原刺激机体产生的特异性免疫球蛋白，主要存在于血清中。抗原和抗体在常规条件下均带负电荷，周围形成水化层，呈亲水胶体状态，不会自行聚合。当二者特异性结合后，电荷减少、水化层破坏，转化为疏水胶体，在电解质作用下聚集形成可见的抗原抗体复合物。该反应具有特异性（有共同抗原时可出现交叉反应）、可逆性（非共价键结合）和比例性（比例适当时才可见可见反应）凝集反应是颗粒性抗原（如细菌、红细胞）与相应抗体结合出现凝集物的现象，分为直接凝集（颗粒性抗原与抗体直接结合）和间接凝集（可溶性抗原吸附于载体后再与抗体结合）。本实验采用玻片凝集反应——将已知抗体与未知菌体在玻片上混合，数分钟后出现凝集即为阳性，该方法简便快速，常用于菌种鉴定。三、实验材料与设备主要实训材料1.菌种沙门氏菌（Salmonellasp.）、大肠杆菌（Escherichiacoli）的单菌落平板2.材料载玻片、接种环、酒精灯、记号笔3.试剂沙门氏菌多价诊断血清稀释液、无菌生理盐水四、实验案例4.1实验流程四、实验案例4.2操作要点（1）将菌落涂于生理盐水或者血清稀释液中时，注意不要把液体涂开，使菌种与液体混合均匀即可。（2）观察凝集反应结果时，注意区分是否产生沉淀，或者呈均匀浊液。四、实验案例4.3实验设计（1）取洁净载玻片一张，用记号笔划成三格，标识1、2、3。（2）于1格内滴加1滴生理盐水，2格、3格分别滴上1滴沙门氏菌多价诊断血清稀释液。（3）用接种环以无菌操作分别挑取少量沙门氏菌菌落，涂于1格生理盐水和2格血清中，使菌种与液体混合均匀，灼烧接种环灭菌（4）用接种环以无菌操作挑取大肠杆菌菌落，涂于第3格中，使菌种与液体混合均匀，灼烧接种环灭菌。（5）轻轻摇动载玻片，1~2min后观察结果，看是否有凝集现象出现，是否出现白色凝集块。四、实验案例4.4结果与分析观察并记录实验结果，完成下表。内

容现

象结

论沙门氏菌﹢生理盐水

沙门氏菌﹢沙门氏菌血清

大肠杆菌﹢沙门氏菌血清

五、思考题1.解释凝集反应的原理。2.举几个例子说明凝集反应在食品微生物检验中的应用。食品中菌落总数的测定08一、实验目的掌握食品中菌落总数测定的基本原理和操作方法。学习国标GB4789.2-2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》的标准方法。熟悉倾注平板法（pourplatemethod）的操作流程和数据分析方法。二、实验概述菌落总数测定是评估食品中好氧和兼性厌氧异养微生物数量的常规方法。本试验采用标准平皿法对样品中的总菌落进行计数。由于样品中微生物可能以单独个体、成对、链状、成簇或成团等形式存在，且没有一种培养基或培养条件能满足所有微生物的生理需求，因此此法所得的菌落数实际上低于样品中真正存在的活菌数目。菌落总数是指食品检样经处理后，在一定条件下培养所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。本实验中，菌落总数特指1mL（g）样品在平板计数琼脂（PCA）培养基中，（36±1）℃培养（48±2）h后生长的菌落数（CFU）。三、实验材料与设备主要实训材料平板计数琼脂培养基；酒精灯、试管架、无菌试管、记号笔、无菌采样瓶（或均质袋）、无菌移液管、无菌培养皿、无菌锥形瓶；天平（精度0.1g）、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、pH计或精密pH试纸；无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.8）或0.85%无菌生理盐水主要实训设备无菌均质器（拍打器）、恒温培养箱四、实验案例4.1实验流程四、实验案例4.2操作要点（1）取样要均匀，具有代表性。（2）梯度稀释是本实验成功的关键，注意无菌操作。（3）培养基需冷却至46～50℃后再倒入平皿，避免高温杀菌。（4）倾注培养基时，避免直接冲到样品稀释液，以免因培养基温度过高杀死细菌。（5）不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比，即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错，不应作为检样计数报告的依据。（6）培养结束后需高压蒸汽灭菌处理所有培养物，防止污染扩散。四、实验案例4.3实验设计（1）样品稀释液制备固体/半固体样品：称取25g样品置盛有225mL稀释液的无菌均质杯内，8000～10000r/min均质1～2min，制成1:10样品匀液液体样品：吸取25mL样品置盛有225mL稀释液的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1:10样品匀液10倍递增稀释：吸取1:10匀液1mL注入盛有9mL稀释液的试管中，振摇混匀，制成1:100匀液。每递增稀释一次，换用1支吸管加样与倒平板：根据样品污染状况选择1～3个适宜稀释度，各吸取1mL于无菌平皿内（每个稀释度做两个平行），同时吸取1mL空白稀释液作空白对照。倾注15～20mL冷却至46～50℃的PCA培养基，混匀（2）培养

待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h四、实验案例4.3实验设计（3）菌落计数选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数。低于30CFU记录具体菌落数，大于300CFU记为多不可计。每个稀释度取两个平板平均数（4）菌落总数计算只有一个稀释度在适宜范围内→取两平板平均值×稀释倍数有两个连续稀释度在适宜范围内→按公式N=∑C/(n₁+0.1n₂)d计算所有平板均＞300CFU→取最高稀释度平板计数×最高稀释倍数所有平板均＜30CFU→取最低稀释度平均菌落数×稀释倍数所有平板均无菌落生长→＜1×最低稀释倍数均不在30～300之间→以最接近30或300的平均菌落数×稀释倍数四、实验案例4.3实验设计（5）结果报告菌落数＜100CFU→四舍五入，以整数报告菌落数≥100CFU→第3位四舍五入，取前2位，后面以0代替（或用10的指数形式，两位有效数字）蔓延菌落无法计数→报告“菌落蔓延”空白对照有菌落生长→结果无效称重取样以CFU/g报告，体积取样以CFU/mL报告四、实验案例4.4结果与分析样品中的菌落总数：稀释度平板上菌落数结果CFU／mL12

对

照

五、思考题如何决定检验样品的最高稀释度?要使平板菌落计数结果准确，需要注意哪些方面?MPN法测定食品中的大肠菌群数09一、实验目的掌握MPN（MostProbableNumber）法测定食品中大肠菌群数的基本原理和操作方法。学习国标GB4789.3-2025《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》的标准方法。掌握大肠菌群的初发酵试验和复发酵试验的操作流程，并能够根据实验结果推算食品中的大肠菌群数。二、实验概述大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧，能发酵乳糖，在乳糖培养基中经36℃±1℃培养24～48h，能产酸产气、革兰氏阴性、无芽孢杆菌的总称。它们广泛存在于自然界、人及动物肠道中，是食品污染程度的重要指示菌。MPN（MostProbableNumber）法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最可能数。MPN法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数。三、实验材料与设备主要实训材料月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤、无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.8）或0.85%无菌生理盐水、无菌采样瓶、无菌移液管、无菌培养皿、无菌试管、酒精灯、试管架、无菌锥形瓶、杜氏小管等。主要实训设备天平（0.1g）、均质器（拍打器）及无菌均质袋或无菌均质杯、pH计或精密pH试纸、恒温培养箱36℃±1℃、30℃±1℃。四、实验案例4.1检验程序四、实验案例4.2操作要点（1）无菌操作（2）样品稀释

用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意移液管尖端不要触及稀释液面)，振摇试管使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。以此类推

每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头

每次吸取前，必须再次振荡、混匀待吸取的稀释液四、实验案例4.2操作要点（3）稀释度的选择与判断：预期值30~300CFU/皿

根据产品的标准

根据经验（4）倾注平皿时培养基的温度，并转动平皿使其混合均匀（5）检查LST肉汤管中杜氏小管有无气泡四、实验案例4.3实验设计（1）分装生理盐水：9mL/支试管，每人分装2支（2）梯度稀释：10-1、10-2、10-3（根据实际情况确定稀释倍数）（3）加样：10-1、10-2、10-3三个稀释度样品，用移液管吸取1mL到LST液体培养基中（4）培养：将已接种样品的LST肉汤管置于36℃±1℃培养24h±2h，观察小倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。四、实验案例4.4实验设计（5）复发酵实验：轻轻振摇各产气的LST肉汤管，用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养24h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。四、实验案例4.5结果与分析根据复发酵试验中3个适宜连续稀释度中大肠菌群阳性的管数，按照表检索MPN表，报告每100g（mL）样品中大肠菌群的MPN值，以MPN/100g（mL）表示。五、思考题什么是大肠菌群，测检食品中大肠菌群的意义是什么?常用什么培养基?该培养基中各种成分的主要作用是什么?这是一类什么性质的培养基?食品中金黄色葡萄球菌的定性检验10一、实验目的学习国标GB4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》的标准方法。掌握食品中金黄色葡萄球菌的定性检验的方法。掌握金黄色葡萄球菌的生物学特性，理解其在食品安全中的重要性。二、实验概述金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌，在Baird-Parker平板上形成的菌落呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、直径为2~3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色的边缘，周围绕以不透明圈，其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄球菌的重要生化试验，其原理如下：金黄色葡萄球菌可产生两种类型的凝固酶：（1）游离凝固酶：分泌至菌体外，能激活血浆中的凝固酶原反应因子，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，导致血浆凝固。（2）结合凝固酶（凝聚因子）：位于菌体表面，可直接与血浆中的纤维蛋白原结合，引发凝集反应。三、实验材料与设备主要实训材料金黄色葡萄球菌标准菌株、待测食品样本（如奶制品、肉类等）、7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker培养基、脑心浸出液肉汤（Brain-HeartInfusionBroth,BHI）、营养琼脂、兔血浆、磷酸盐缓冲液、革兰氏染色液、无菌生理盐水、无菌试管、无菌锥形瓶、、无菌吸管、无菌培养皿等。主要实训设备无菌均质器、恒温培养箱、天平、普通光学显微镜、pH计四、实验案例4.1检验程序四、实验案例4.2操作要点（1）操作过程中要严格遵循生物安全规程，处理金黄色葡萄球菌时佩戴手套和口罩。（2）所有实验废弃物需按照生物安全规范进行处理。（3）如果血浆凝固酶的结果可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI，36°C±1°C培养18h~48h，重复试验。四、实验案例4.3实验设计（1）样品预处理称取25g样品至225mL含有7.5%氯化钠肉汤的无菌均质袋内，用无菌均质器拍打1min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。（2）增菌将上述样品匀液置于36℃±1℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌在7.5%的氯化钠肉汤中呈浑浊生长。（3）分离将增菌后的培养物划线接种到Baird-Parker平板和血平板上。血平板在36℃±1℃下培养18~24h，Baird-Parker平板在36℃±1℃下培养24~48h。四、实验案例4.3实验设计（4）初步鉴定

金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形，表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm~3mm，颜色呈灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有清晰带（图2-21）。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。

在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。

选取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

四、实验案例4.3实验设计（5）确证鉴定 1）染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，直径约为0.5μm—1μm。2）血浆凝固酶试验：从Baird‑Parker平板或血平板选取不少于5个可疑菌落（不足5个则全取），分别接种BHI液体培养基、营养琼脂斜面，36℃±1℃培养18–24h；取0.5mL新鲜兔血浆，加入0.2–0.3mLBHI菌液混匀，36℃±1℃孵育6h，每0.5h观测一次，试管倾斜/倒置出现凝块、凝固体积超一半即为阳性，同步设置血浆凝固酶阳、阴性菌株作对照四、实验案例4.4结果与分析金黄色葡萄球菌在Baird-Parker培养基上的菌落菌落Baird-Parker平板血平板菌落特征菌落特征溶血圈

记录观察到的菌落在Baird-Parker平板和血平板上的特征，如圆形、光滑、凸起、湿润、颜色等，以及是否出现溶血圈等。五、思考题该检测金黄色葡萄球菌方法的适用范围有哪些？要保证实验结果的准确性，有哪些注意事项？本实验为金黄色葡萄球菌的定性检验，如果要定量检验，可以采用哪些防范？泡菜中乳酸菌的分离、鉴定与表征11一、实验目的掌握从发酵食品（泡菜）中分离、纯化乳酸菌的基本方法。学习并运用生化鉴定方法初步鉴定乳酸菌。掌握乳酸菌生长曲线和产酸能力的测定方法。二、实验概述乳酸菌在自然界中分布极为广泛，常见于多种传统发酵食品中，如乳制品、泡菜、酸汤、酸笋等。乳酸菌将己糖（如葡萄糖）分解产生乳酸的生物学过程称为乳酸发酵。在泡菜的发酵过程中，附着于蔬菜表面的天然乳酸菌利用蔬菜中的可溶性糖类进行厌氧或兼性厌氧发酵，产生大量乳酸及其他有机酸、醇、酯等风味物质，进而赋予了泡菜独特的风味。从泡菜等发酵食品中分离、纯化、鉴定乳酸菌，并研究其生长与产酸特性，对于理解传统发酵机理、筛选优良发酵剂菌株以及优化生产工艺具有重要的理论和实践意义。三、实验材料与设备实验材料泡菜样品、MRS（DeMan,RogosaandSharpe）液体培养基、MRS固体培养基（平板）、MRS固体培养基（含碳酸钙）、培养皿、接种环、涂布棒、载玻片、盖玻片、酒精灯、锥形瓶、烧杯、比色皿、试管、移液管、革兰氏染色液、过氧化氢溶液、无菌生理盐水、氢氧化钠标准溶液、酚酞指示剂、蒸馏水实验设备恒温培养箱、显微镜、高压灭菌锅、pH计、紫外可见分光光度计、磁力搅拌器、碱式滴定管、涡旋振荡器、高速离心机四、实验案例4.1检验程序四、实验案例4.2操作要点（1）无菌操作：分离、纯化、接种及取样全过程需严格遵守无菌操作规程，防止杂菌污染。（2）培养条件：多数乳酸菌为兼性厌氧或耐氧厌氧菌，创造厌氧或微需氧环境（如使用厌氧罐、培养袋）通常有利于其生长与产酸。（3）样品稀释：分离菌株时，进行合理的梯度稀释是获得分散、独立单菌落的关键，直接影响后续纯化与鉴定的准确性。四、实验案例4.2操作要点（4）仪器使用：分光光度计使用前需预热，比色皿透光面需清洁，测量时需用空白培养基准确调零。pH计使用前后必须用标准缓冲液进行校准，以确保数据准确。（5）滴定操作：滴定的终点判断要一致（微红，30s不褪色）。NaOH标准溶液需准确配制与标定。滴定前需检查滴定管是否漏液并排除尖端气泡。四、实验案例4.3实验设计（1）乳酸菌的分离样品前处理梯度稀释涂布分离培养菌落观察和纯化四、实验案例4.3实验设计（2）乳酸菌的初步鉴定革兰氏染色：依据《实验一细菌和放线菌形态特征观察》取纯化后的单菌落制片，进行革兰氏染色。显微镜观察，记录染色结果（紫色为阳性，红色为阴性）、细菌的个体形状（球状、杆状）等。过氧化氢酶试验：依据《实验六细菌的代谢与生化反应》，用接种环挑取纯化后的单菌落，涂于已滴有过氧化氢溶液的载玻片上，立即观察是否有大量气泡产生。无气泡为阴性（—），有气泡为阳性（+）。乳酸菌通常为过氧化氢酶阴性。四、实验案例4.3实验设计（2）乳酸菌的生长与产酸特性表征生长曲线的测定

种子液制备：挑取纯化单菌落接种于MRS液体培养基，37℃静置培养18-24h，制备种子液。

接种培养：按4%接种量将种子液接入新鲜MRS液体培养基，37℃恒温培养。

取样检测：分别在培养0-16h间隔定时无菌取样，涡旋混匀样品，必要时用MRS培养基稀释，保证OD600数值处于0.2~0.8有效范围；以空白MRS培养基调零，测定各样品OD600值，最终以培养时间为横坐标、OD600为纵坐标绘制菌株生长曲线。四、实验案例4.3实验设计（2）乳酸菌的生长与产酸特性表征产酸能力测定pH测定：在每次测定OD₆₀₀的同一份样品中，使用校准好的pH计直接测定其pH值，并记录。总酸测定（滴定法，以乳酸计）：本方法依据《GB12456-2021食品安全国家标准食品中总酸的测定》的方法进行。四、实验案例4.4结果与分析菌落编号形状大小（mm）边缘隆起度表面颜色

记录从泡菜样品中分离得到的单菌落在MRS平板上的特征，如形状、大小、边缘、隆起度、表面（粗糙/光滑）、颜色等。绘制分离得到的典型单菌落形态图。分离结果：四、实验案例4.4结果与分析将上述分离纯化后单菌落的形态学与生化鉴定结果记录于下表中。鉴定结果：菌落编号革兰氏染色结果G+或G-菌体形态描述（镜检）过氧化氢酶试验结果是否为乳酸菌

注：过氧化氢酶试验结果中“-”表示阴性（无气泡），“+”表示阳性（无气泡）。四、实验案例4.4结果与分析测定并记录目标乳酸菌株在不同培养时间的生长（OD₆₀₀）与产酸（pH、总酸）情况。生长与产酸表征结果：培养时间（h）OD600pH滴定消耗NaOH的体积(mL)总酸（g/L）0

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