食品检测技术综合实训-课件 模块二 食品微生物检验基础技能

食品微生物实验室使用与管理目录01微生物实验室的基本条件02检验员手册03微生物实验室各功能区的划分04微生物致病因子的溢洒处理01微生物实验室的基本条件微生物实验室的基本条件

实验室光线明亮，避免阳光直射。配备纱窗防蚊蝇，安装空调与防尘设备，确保温度适宜、空气清新。

地面及四壁平滑，便于清洁和消毒，保持洁净无菌状态。

微生物实验室的基本条件

实验室应有安全、适宜的电源和安全、充足的水源，确保实验设备正常运行，满足实验用水需求。

配备整洁、稳固、适用的实验台，台面以耐酸碱、防腐蚀的黑胶板为宜。设有相应的橱柜，用于存放显微镜及常用工具、药品。

微生物实验室的基本条件

检验室的工作区域应与办公室区域明显分开，避免交叉污染。一般样品检验应在洁净区域进行，病原微生物分离鉴定工作应在二级生物安全实验室（BSL-2）进行。

检验员操作规范进入检验室应穿工作服，自检验室进入无菌室时要戴口罩、工作帽，换专用鞋，防止微生物污染。不在检验室内接待客人，不抽烟，不饮食，不用手抚摸头部、面部，避免污染样品和自身。检验员操作规范样品检验前应登记生产日期、批号，详细记录样品检验序号、检验日期、检验程序和结果，确保实验可追溯性。凡是要丢弃的培养物应经高压灭菌后处理，污染的玻璃仪器高压灭菌后再洗刷干净，防止病原微生物传播。检验员操作规范接种与灭菌：接种环用前用后均需火焰灭菌，吸过菌液的吸管、沾过菌液的玻片等用后，要浸泡在盛有3%来苏水或5%石炭酸溶液的玻璃筒内。溢洒处理：如有病原微生物溢洒，按照微生物致病因子的溢洒处理部分进行处理，确保实验室安全。危化品管理：易燃化学品如酒精、二甲苯等应远离火源，按规定保存。易挥发性的药品如醚、氯仿等，应放在冰箱内保存。检验员操作规范工作完毕，要仔细检查烘箱、电炉是否切断电源，自来水开关是否拧紧，培养箱、电冰箱的温度是否正常，门是否关严。离开检验室前一定要用肥皂把手洗净，脱去工作衣、帽、专用鞋。关闭门窗以及水、电、气等开关，确保安全。检验员操作规范意外情况的处理（1）遇火险，立即关闭电源开关、天然气开关，如果酒精、乙醚、汽油着火，切勿用水，应以沙土灭火。（2）皮肤破伤，先除尽异物，用蒸馏水或生理盐水洗净后，涂以2%碘酒。（3）灼烧伤，涂以凡士林油、5%的鞣酸或2%的苦味酸。检验员操作规范意外情况的处理（4）化学药品腐蚀伤：若为强酸腐蚀，先用大量清水冲洗，再用5%碳酸氢钠或氢氧化铵溶液洗涤中和之；若为强碱腐蚀，用大量水冲洗后，再用5%醋酸或5%硼酸溶液洗涤中和之。若是眼部受伤，经上述步骤处理后，最后滴入橄榄油或液体石蜡1～2滴。污染物进入嘴内，要立即吐出，并以大量清水漱口，切勿使漱口水咽下，必要时可服用有关药物，以防发生感染。病原微生物污染工作服时，应立即脱下，并用高压蒸汽灭菌器消毒。03实验室功能区划分实验室功能区划分

准备室恒温培养室0102灭菌室03无菌室或洁净室04准备室

用于配制培养基和样品处理等。室内设有试剂柜、存放器具或材料的专柜、实验台、电炉、冰箱和上下水道、电源等。对于较大的食品微生物实验室可另设洗涤间用于洗刷器皿等。室内应备有加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，还应有各种瓶刷、去污粉。灭菌室主要用于培养基的灭菌和各种器具的灭菌，室内应备有高压蒸汽灭菌器、烘箱等灭菌设备及设施。无菌室结构无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。高以2.5m以下为宜，都应有天花板。无菌室结构分隔内室与外室的墙壁上部应设带空气过滤装置的通风口。需安装恒温恒湿机。内外室都应在室中央安装紫外线灯，以供灭菌用。无菌室设备与用具内室通常配备各类培养箱、培养架、培养盒。外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、手持喷雾器和5%石炭酸溶液、70%酒精棉球等。灭菌、消毒同无菌室的灭菌、消毒措施。小规模的培养可不启用恒温培养室，而在恒温培养箱中进行。恒温培养室结构（1）无菌室应有内、外两间，内间是无菌室，外间是缓冲室。内间面积2m×2.5m=5m²，外间面积1m×2m=2m²，房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。高以2.5m以下为宜，都应有天花板。恒温培养室结构（2）内间应当设拉门，以减少空气的波动，门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉门，要设在距内间最远的位置上。（3）在分隔内间与外间的墙壁或“隔扇”上，应开一个小窗，作接种过程中必要的内外传递物品的通道，以减少人员进出内间的次数，降低污染程度。小窗宽60cm、高40cm、厚30cm，内外都挂对拉的窗扇。恒温培养室结构（4）无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。通气窗应设在内室进门处的顶棚上（即离工作台最远的位置），最好为双层结构，外层为百叶窗，内层可用抽板式窗扇。通气窗可在内室使用后、灭菌前开启，以流通空气。有条件可安装恒温恒湿机。恒温培养室设备与用具工作台，都要求表面光滑和台面水平；在内室和外室各安装一个紫外灯；外室应有专用的工作服、鞋、帽、口罩、盛有来苏儿水的瓷盆和毛巾、手持喷雾器和5%石炭酸溶液等。内室应有酒精灯、常用接种工具、70%的酒精棉球、废物筐等。灭菌、消毒恒温培养室工作规程无菌室内墙壁应光滑，尽量避免死角，便于洗刷消毒。应保持密封、防尘、清洁、干燥。操作时尽量避免走动。工作台、地面和墙壁应用新洁尔灭或过氧乙酸溶液擦洗消毒。无菌室内应备有专用开瓶器、金属勺、镊子、剪刀、接种针、接种环，每次使用前后应在酒精灯火焰上烧灼灭菌。杀菌前做好一切准备工作，然后用紫外线杀菌灯进行空气消毒。工作中应注意安全。恒温培养室熏蒸消毒熏蒸是无菌室彻底灭菌的措施。主要采取甲醛熏蒸消毒法，熏蒸后关门密闭应保持12h以上。熏蒸后12h，再量取与甲醛溶液等量的氨水，迅速放入室内，同时敞开门窗放出剩余的有刺激性的气体。恒温培养室无菌程度的测定一般采用平板法测定无菌室的无菌程度。（1）将已灭菌的营养琼脂培养基分别倒入已灭过菌的培养皿内，每皿约15mL培养基，启开皿盖暴露于无菌室内的不同地方，30min后，盖好皿盖。（2）将培养皿倒置，于37℃培养48h后，观察菌落情况，统计菌落数。（3）如果每一个培养皿内菌落不超过4个，则可以认为无菌程度良好，若菌落数很多，则应再重复以上步骤，进一步对无菌室进行灭菌。04微生物致病因子溢洒处理实验室功能区划分

一般处理原则评估与报告0102生物安全柜内03离心机内04一般处理原则1、洒溢处理前需戴手套，穿防护服，必要时需进行脸和眼睛防护，准备清理工具和物品。2、提前准备好清理工具和物品，如纸巾、消毒剂、专用收集袋或容器等；3、往纸巾上倾倒2000mg/L消毒剂（0.2%次氯酸钠溶液），并立即覆盖周围区域，从外围向中心处理，作用30min后，小心收集吸收材料及溢洒物，反复吸净剩余物质，确保彻底清理。如果含有碎玻璃或其他锐器，则要使用簸箕或硬的厚纸片和大镊子来收集处理过的物品，并将它们置于锐器盒以待处理。一般处理原则4、对溢出区域再次清洁并消毒；5、将处理的溢洒物及工具置于防漏、防穿透的废弃物处理容器中封好等待消毒处理，脱去接触溢洒物的防护装备，洗手，防止微生物致病因子通过废弃物传播。生物安全柜内溢撒1.处理溢洒物时不要将头伸入安全柜内，也不要将脸直接面对前操作口，而应处于前视面板的后方。消毒灭菌剂不得对生物安全柜造成腐蚀。2.如果溢洒的量不足1mL时，可直接用消毒灭菌剂浸湿的纸巾擦拭。3、溢洒量大或容器破碎时（1）使生物安全柜保持开启状态。（2）在溢洒物上覆盖浸有消毒灭菌剂的吸收材料。（3）在安全柜内对所戴手套消毒灭菌后，脱下手套。（4）穿好适当的个体防护装备。生物安全柜内溢撒（5）小心将吸收了溢洒物的纸巾及溢洒物收集到专用的收集袋或容器中，并反复用新的纸巾将剩余物质吸净；破碎的玻璃或其他锐器要用镊子或钳子处理。（6）用消毒灭菌剂擦拭或喷洒安全柜内壁、工作表面以及前视窗的内侧；作用30min后，用洁净水擦干净。（7）如果需要浸泡接液槽，要先报告主管人员。4.如果溢洒物流入生物安全柜内部，需评估后再采取措施。离心机内溢撒1.使用密封管以及密封的转子或安全桶。使用前，检查并确认所有密封圈都在位并状态良好。2.离心结束后，至少等候5min打开离心机盖。3.打开盖子后发现离心机已经被污染，立即小心关上。若离心期间离心管破碎，立即关机，不要打开盖子。切断离心机的电源，30min后开始清理工作。4.穿着适当的个体防护装备，准备好清理工具。5.消毒灭菌后小心将转子转移到生物安全柜内，浸泡在适当的非腐蚀性消毒灭菌液内，浸泡60min以上。离心机内溢撒6.将离心管转移到专用的收集容器中。7.用适当的消毒灭菌剂擦拭或喷雾的方式消毒灭菌离心转子仓室和其他可能被污染的部位，空气晾干。8.若溢洒物流入离心机的内部，需评估后采取适用的措施。评估与报告1、对溢洒处理过程和效果进行评估2、对实验室进行彻底的消毒灭菌处理和对暴露人员进行医学评估3、按程序记录相关过程和报告。谢谢观看项目二、微生物检验基本操作技术目录01培养基的制备02斜面和平板的制备03灭菌前的准备04高压蒸汽灭菌锅的使用目录05接种06分离纯化与转种07微生物菌种的保藏01培养基的制备一、培养基的基本知识培养基的定义

培养基是指人工配置的用于微生物生长和繁殖的营养基质，含有微生物生长所必须的营养物质。

培养基的成分

培养基主要包括营养物质(氮源、碳源、无机盐、生长因子、水)和凝固剂营养物质主要是氮源、碳源、无机盐、生长因子和水培养基的分类

按物理状态分：液体培养基、固体培养基、半固体培养基

按用途分类：基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基

二、培养基的制备材料和仪器的准备

化学试剂：蛋白胨、酵母提取物、琼脂、无机盐、蒸馏水等。

仪器设备：pH计、天平、搅拌器、电炉或水浴锅、高压灭菌锅、试管、培养皿、三角瓶等。制备步骤称量

溶解调节pH：1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠。分装：锥形瓶或试管。包扎：橡胶塞或棉塞盖住管（瓶）口，外覆牛皮纸包扎。灭菌：121℃，15-20min或112℃下灭菌30min（含糖培养基），不耐高温的培养基需滤过除菌。倒平板：保温至50℃倒平板。

02斜面和平板的制备一、斜面培养基的制备

准备培养基

称量培养基各组分，加热溶解并调节好PH值，保温备用。

分装

分装于试管中，装液量约为试管的1/5-1/4。

包扎与灭菌

用棉塞（橡胶塞）塞住试管口，覆盖上牛皮纸或报纸后捆扎，高压灭菌。

制作斜面

试管倾斜摆放自然凝固成斜面，斜面的长度不超过试管长度的一半为宜。二、平板培养基的制备

配制培养基溶液

培养基准备同斜面，需先分装于锥形瓶中高压灭菌，于50℃水浴保温备用。

倒平板

点燃酒精灯，左手取灭菌后的空白平板，打开培养皿盖，右手持锥形瓶，倒入液体量为10-15ml（厚度大约为3mm），迅速盖好培养皿盖子，平放于桌面上，轻轻晃动培养皿，让培养基均匀分布于平皿中，冷却后即制成平板。三、培养基的质量检查与保藏

培养基质量检查

制备好的斜面和平板培养基需经37℃、24h培养检查是否有污染。

培养基保藏

检查后无污染的培养基可保存于4℃冰箱中备用。03灭菌前的准备一、物品清洗新购置玻璃器皿的清洗

盐酸或洗涤液中浸泡数小时，清水冲洗干净。

使用过的玻璃器皿的清洗

试管、培养皿、锥形瓶、烧杯的洗涤

不带菌物品用洗涤剂浸泡后，清水冲洗干净，有油污的碱液煮后肥皂水浸泡，清水冲洗干净；带菌物品需高压灭菌后再进行清洗。

玻璃吸管的洗涤

用后立即投入2%甲酚皂溶液或0.25%苯扎溴铵中浸泡24h，再用清水冲洗干净。

二、玻璃器皿的干燥自然晾干

不急用物品可倒置于架子或盘子中，放于通风干燥处晾干。

烘干

急用物品可置于干燥箱中烘干。

三、玻璃器皿的包扎培养皿的包扎5-10套叠在一起，用牛皮纸或报纸完整的包起来，或放入特制的金属筒内。移液管的包扎

移液管的上端塞入少许棉花，再用3-4cm宽的长纸条将移液管完全卷起来，或放入特制的金属筒内。试管和锥形瓶的包扎

管口和瓶口加上棉塞或橡胶塞，外面用牛皮纸或报纸包裹，试管7支或10支扎成一捆。

04高压蒸汽灭菌锅的使用一、灭菌步骤加水

使用前检查水位线，使其保持在刻度线上。

装锅

待灭菌的物品置于灭菌锅内，相互之间要留有间隙。密封

盖子要旋（盖）紧，密闭良好

加热排气

打开放气阀，接通电源开关，当放气阀有水蒸汽排出并持续排气一段时间后，再关闭排气阀，压力表数字开始上升。

单击此处添加标题升压灭菌

压力到达额定功率时，放气阀自动放气，这时才开始计算灭菌时间。

降压冷却

灭菌完成，关闭电源，带压力表降至0时，才可以打开盖子，取物品时注意防止烫伤，可待其自然冷却后再行取出。

二、注意事项注意检查水位线是否在刻度线上。灭菌开始前必须充分排出冷空气。重放溶液的容器盖子必须有一定的透气性。压力表回零前不能打开灭菌锅盖子。防止烫伤使用完毕，最好排干净水并擦干。

05接种一、接种前的准备无菌室的准备

接种通常需要在无菌室内的超净工作台中进行，需消毒灭菌后再行操作。

接种工具的准备

准备必要的接种工具，工具在使用前需要消毒灭菌。

二、接种方法平板接种法

划线法：适用于细菌的分离培养。

涂布法：常用于细菌的计数和药敏试验。

倾注法：可用于细菌的计数，也可进行细菌的分离。斜面接种法：用于细菌的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些生化特性。

穿刺法：用于观察细菌在半固体等培养基中的生长特性。

液体接种法：用于观察细菌在其中的生长特性，也可以进行细菌的扩大培养和发酵生产。

06分离纯化与转种一、平板划线分离法采集样品：无菌采集待检样品并进行预处理。划线分离

无菌取少许带检样，在平板的第一区连续之字形划线，灭菌冷却后，在第二区继续划线，划线时要通过第一区的数条线开始划。依此方法划线第三区和第四区。

恒温培养：37℃、24h恒温培养菌落观察与转种

在平板上挑选形态、颜色等特征一致的单菌落，观察其特点。往往一次得不到纯的培养物，要通过数次转接培养才能获取单菌落。二、倾注和涂布平板法分离纯化倾注平板法

以输入小涂布平板法

以输入

涂布平板法

倒平板菌种稀释滴加菌液涂布平板恒温培养挑取菌落倾注平板法培养皿编号稀释菌液吸取菌液倒培养基恒温培养挑取菌落二、倾注和涂布平板法分离纯化三、注意事项用于划线和涂布的培养基，琼脂含量宜高些，平板太软易划破。

在倾注平板时，培养基温度不能太高，否则会烫死微生物。倒平板时培养基温度过高，也容易在平板表面形成冷凝水，导致菌落扩散蔓延。

07微生物的菌种保藏一、保藏方法低温保藏法

用斜面培养基4℃保藏，简单易行，保藏期较短，需定期进行转接，菌种易退化。

冷冻保藏法：将菌种于-20℃以下长期保藏，操作较为繁琐，设备要求高。

冷冻干燥保藏法（冻干法）

将菌悬液分装于安瓿管进行冻结，用冷冻干燥机抽真空，密封后置于4℃下可长期保存。

液氮冷冻超低温保藏法

将菌悬液分装安瓿管中密封，缓慢降温至-80℃预冷，然后转移至液氮罐中长期保存。

液体石蜡保藏法

将菌种于斜面培养基或半固体培养基上培养好后，注入灭菌好的液体石蜡进行覆盖隔绝空气，抑制微生物的代谢活动，可较长时间保存（1-2年）

载体干燥保藏法：将菌种吸附在适当的载体上，可密封保存几年到十几年。

滤纸保藏法

将滤纸剪成小条置于安瓿管中灭菌，菌种和灭菌脱脂牛乳混匀制成悬液，滤纸条放入菌悬液中充分吸饱后放回安瓿管中，抽真空后封口保藏。

沙土管保藏法

分别取沙和土过筛，按2：1混合均匀，灭菌后装入安瓿管中制成沙土管，收集微生物孢子制成孢子菌悬液，取0.5ml注入沙土管中，抽真空后密封保藏。

二、注意事项要根据菌种的特点、保存的要求和条件选择适合的保藏方法。保藏典型优良菌种，最好选取分生孢子、芽孢等休眠体进行保藏。创造良好的保藏条件，尤其是温度和干燥。合理使用甘油、脱脂牛奶等保护剂。严格无菌操作，避免污染。定期检测菌种活性，及时传代。

谢谢观看项目三、微生物检验基础实训目录01食品中菌落总数的测定02食品中大肠菌群数的测定03食品中金黄色葡萄球菌的检验04食品中沙门氏菌属的检验01食品中菌落总数的测定一、菌落总数的概念食品中菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基成分、培养条件等）培养后，所得每g（ml）检样中形成的微生物菌落总数。二、菌落总数测定的意义菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可用于观察细菌在食品中繁殖的动态，从而对被检样品进行卫生学评价提供依据。

三、菌落总数的检测方法方法：《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB4789.2-2022）。原理：样品经过稀释后，使样品悬液中的细菌分散存在，接种一定量到培养基中，再加入适量培养基，充分混匀。微生物在培养基中分散而呈单个存在，一个菌体长出一个肉眼可见的菌落，计算菌落数可推出菌体数。最终以菌落形成单位数（CFU）报告。

（一）所需设备及试剂耗材恒温培养箱、冰箱、天平、均质器、振荡器、无菌吸管、微量移液器及吸头、锥形瓶、培养皿、pH计或pH比色管或精密pH试纸、放大镜、菌落计数器。平板计数琼脂培养基、菌落总数测试片、磷酸盐缓冲液、生理盐水。

（二）检验程序（三）操作步骤1、样品的稀释①对于固体和半固体样品：称取25g样品置于225mL无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水中，8000-10000r/min均质1-2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。②如为液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水中，充分混匀，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。

③用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，注入盛有9mL稀释液的试管中，振荡均匀，制成1：100的样品匀液。

④按上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每次都要换无菌吸管或吸头。⑤根据对样品污染状况的估计，选择1-3个适宜稀释度的样品匀液，吸取1mL于无菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。同时，再分别吸取1mL空白稀释液加入两个培养皿内作为空白对照。⑥将15-20mL冷却至46-50℃的平板计数琼脂培养基倾注培养皿，并转动培养皿使其混合均匀。

单击此处添加标题2、培养①水平放置待琼脂凝固后，将平板翻转，（36±1）℃培养（48±2）h，水产品（30±1）℃培养（72±3）h。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面蔓延生长的菌落，可在凝固后的琼脂培养基表面覆盖一薄层平板计数琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，进行培养。②如使用菌落总数测试片，应按照测试片所提供的相关技术规程操作。

单击此处添加标题3、菌落计数

①培养完成后要立即计数，每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。。

②可用肉眼观查，必要时用放大镜或菌落计数器，菌落计数以菌落形成单位（CFU)表示。

③选取菌落数在30-300CFU、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

（四）结果与计算1、菌落总数的计算方法

①根据平板上的菌落数的多少以及是否都在在适宜计数范围内，分别按公式进行计算，作为每ｇ（ｍＬ）样品中菌落总数结果，

2、菌落总数的报告

①菌落总数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。②菌落总数大于或等于100CFU时，第三位数字采用“四舍五入”的原则修约后，采用两位有效数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。③若空白对照上有菌落生长，则此次检验结果无效。④重量取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/L为单位报告。02食品中大肠菌群数的测定一、大肠菌群的概念大肠菌群是指一群在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰染色阴性无芽孢杆菌，包括肠杆菌科中的埃希菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属四个属中的一部分和沙门菌属的第Ⅲ亚属（能发酵乳糖）中的细菌。

二、大肠菌群检测的意义大肠菌群主要来自于人畜的粪便，在食品和饮水中检出，则表明可能受粪便污染。测定大肠菌群含量表明食品被粪便污染的程度，以便为被检样品进行卫生学评价时提供依据，具有重要的卫生学意义。

三、大肠菌群检验的原理依据GB4789.3-2025食品安全国家标准中大肠菌群计数法，第一法大肠菌群最大可能数（MPN）计数法，适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数，MPN计数法是基于泊松分布的一种间接计数方法。样品经过处理与稀释后，用LST肉汤进行初发酵，观察肉汤管产气情况，可证实样品中是否存在大肠菌群。初发酵产气管，不能肯定就是大肠菌群，经过复发酵实验后，有时也可能为阴性。因此，在实际检测工作中，需用煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤做验证实验。

四、检验所需的仪器设备和耗材恒温培养箱、冰箱、恒温水浴箱、天平、均质器及无菌均质袋、均质杯、振荡器、试管、小倒管（杜氏管）或其他合适产气收集装置、无菌吸管或微量移液器及无菌吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、pH计或精密pH试纸、接种环、放大镜或菌落计数器。

磷酸盐缓冲液、0.85%无菌生理盐水、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液、大肠菌群计数测试片。

六、大肠菌群MPN计数法

（第一法）1、检验程序2、操作步骤（1）样品的稀释①固体和半固体样品：取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的均质杯内，8000-10000r/min均质1-2min，或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。②液体样品：吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的锥形瓶中充分混匀，制成1：10的样品匀液。

单击此处添加标题③调节样品匀液的pH在6.5-7.5之间。

④用无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中，混合均匀，制成1：100的样品匀液。

⑤根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每次均需更换无菌吸管或吸头。

（2）初发酵实验选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液各1mL，每个稀释度接种3管LST肉汤，从制备样品至接种完毕，全过程不得超过15min。将已接种样品的LST肉汤管置于36±1℃培养24±2h，观察倒管内是否有气泡产生，产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。若培养至48±2h，所有LST肉汤管均未产气，按照附录中的MPN检索表，报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值，以MPN/g（mL）表示。

（3）复发酵实验（证实试验）轻轻振摇各产气的LST肉汤管，分别用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36±1℃培养48±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。未产气者则继续培养至48±2h再检查产气情况，产气者判断为大肠菌群阳性，仍未产气者判断为大肠菌群阴性。

阴性

阳性

阴性

阳性

月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤

煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤3、结果与报告根据复发酵试验中3个适宜连续稀释度中大肠菌群阳性的管数，按照附录中的MPN检索表，报告每克（毫升）样品中大肠菌群的MPN值，以MPN/g（mL）表示。

03食品中金黄色葡萄球菌的检验一、金黄色葡萄球菌的基本知识（一）生物学特性1、形态与染色

球形，直径为0.5-1.0μm，常排列成葡萄串状，革兰氏染色阳性，无鞭毛，无芽孢，大多数无荚膜。

2、培养特性

营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度为37℃，最适pH值为7.4，耐盐性强，可在含10%-15%氯化钠的培养基中生长。

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在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长。在普通琼脂平板上形成直径1-2mm圆形凸起、光滑、不透明的菌落。血平板上菌落圆形、不透明、表面光滑，周围有β溶血环。在Baird-Parker平板上为圆形，湿润，直径为2-3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘色淡，周围为一浑浊带，在其外层有一透明圈，用接种针接触菌落，似有奶油树胶的硬度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无浑浊带及透明带。长期保存的冷冻或干燥食品中分离的菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙且干燥。

单击此处添加标题3、生化特性

金黄色葡萄球菌可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气，致病菌多能解甘露醇，甲基红反应阳性，V-P反应弱阳性。多数菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，不产生吲哚。此外，致病菌还能液化明胶。4、抵抗力

金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，80℃、30min可灭活；对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、金霉素、红霉素和庆大霉素等高度敏感，但易产生耐药性。

单击此处添加标题（二）流行病学

金黄色葡萄球菌在自然界中分布广泛，空气、土壤、水及人和动物的排泄物中都可找到，金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起败血症、脓毒症等全身感染。

金黄色葡萄球菌肠毒素还常常引起的食物中毒，中毒食品以乳、肉、蛋、鱼及其制品常见。金黄色葡萄球菌可通过污染食品原料、食品从业人员带菌以及食品包装和运输过程中污染。

金黄色葡萄球菌的流行病学一般呈季节分布，多见于春夏季。

二、设备和试剂材料

恒温培养箱、冰箱、恒温水浴箱、天平、均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、菌培养皿、涂布棒、pH计或pH比色管或精密pH试纸。10%氯化钠胰酷胨大豆肉汤、营养琼脂小斜面、血脂平板、Baind-Parker琼脂平板、7.5%氯化钠肉汤、脑心浸出液肉汤、兔血浆、磷酸盐缓冲液、革兰染色液、0.85%无菌生理盐水。

三、金黄色葡萄球菌检验方法（第一法）（一）检验程序

（二）操作步骤1、样品的处理

取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的均质杯内，8000-10000r/min均质1-2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶中，振荡混匀。

单击此处添加标题2、增菌

将上述样品匀液于36±1℃培养18-24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。3、分离

将增菌后的培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36±1℃培养18-24h，Baird-Parker平板36±1℃培养24-48h。

单击此处添加标题4、初步鉴定

观察检样在Baird-Parker平板上和血平板上的生长特点是否符合金黄色葡萄球菌的特点，

在血平板上，金黄色葡萄球菌可形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。

挑取符合特点的可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

单击此处添加标题5、确证鉴定

（1）染色镜检：可疑菌落染色镜检，是否符合金黄色葡萄球菌的特点。（2）血浆凝固酶试验：挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落（小于5个全选），分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，36±1℃培养18-24h后观察。

6、结果与报告（1）结果判定：符合初步鉴定和确证鉴定的，可判定为金黄色葡萄球菌。（2）结果报告：在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。

04食品中沙门氏菌属的检验一、沙门氏菌的生物学特性革兰染色阴性,两端钝圆的短杆菌，大小为为（0.6-0.9）*（1-3）μm，不产芽孢及荚膜，多数具有周生鞭毛。兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适pH值为6.8-7.8。对营养要求不高，在普通营养培养基上生长良好，培养18-24h后，可形成中等大小、圆形、表面光滑、无色半透、整齐的菌落，在肉汤培养基中均匀生长。在三糖铁（TSI）琼脂选择性培养基、亚硫酸铋（BS）琼脂选择性培养基、HE琼脂选择性培养基、胆硫乳（DHL）琼脂选择性培养基等选择性培养基上生长，都产生特有的菌落特征。沙门菌不产生尿素酶，不利用丙二酸钠，不液化明胶，在含有氰化钾的培养基上不能生长。能分解赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸脱羧基，不发酵蔗糖、乳糖、水杨苷等。

二、沙门氏菌的流行病学是引起食品污染和食物中毒的重要致病菌，沙门菌可以通过患者或带菌者传播，也可以是被污染的食品、物品进行传播，从而引发食物中毒。沙门氏菌中毒食品多为动物性食品，如各种肉类、蛋类、家禽、水产类及乳类，常见于肉类，尤其是各种熟肉制品，如肉皮冻、熟内脏、猪头肉、剔骨肉、酱卤肉等。沙门菌食物中毒的主要临床症状为急性肠胃炎症状，如呕吐、腹痛、腹泻，腹泻一天可达数次，甚至十多次，还可引起头痛、发热等。

三、设备与试剂耗材1、仪器设备：冰箱、恒温培养箱、恒温装置、均质器、振荡器、天平、、锥形瓶、量筒、均质杯、均质袋、广口瓶、吸管或微量移液器及吸头、培养皿、试管、小玻管、接种环、pH计或精密pH试纸、微生物生化鉴定系统、生物安全柜。

2、试剂耗材：缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、氯化镁孔雀绿大豆胨（RVS）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、