水质 细菌总数的测定 平皿计数法（HJ 1000-2018）

水质细菌总数的测定平皿计数法（HJ1000-2018）前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水中细菌总数的测定方法，制定本标准。本标准规定了测定水中细菌总数的平皿计数法。本标准为首次发布。本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准主要起草单位：江苏省环境监测中心。本标准验证单位：中国环境监测总站、上海市环境监测中心、浙江省环境监测中心、山东省生态环境监测中心、广东省生态环境监测中心、苏州市环境监测中心。本标准由生态环境部2018年12月26日批准，自2019年6月1日起实施，由生态环境部负责解释。1适用范围本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中细菌总数的平皿计数法。本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中细菌总数的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。HJ493水质样品的保存和管理技术规定HJ/T91地表水和污水监测技术规范HJ/T164地下水环境监测技术规范3术语和定义3.1细菌总数水样在营养琼脂培养基上，在36℃±2℃条件下培养48h±2h，所生长出来的需氧和兼性厌氧细菌菌落总数。单位以CFU/mL表示。4方法原理将定量水样或经稀释的水样接种于营养琼脂培养基，在36℃±2℃恒温条件下培养48h±2h，统计平板上生长的细菌菌落数，根据接种水样体积和稀释倍数，计算出水样中的细菌总数。5试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为无菌蒸馏水或无菌去离子水。5.1营养琼脂培养基5.1.1配方：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g～20.0g，溶于1000mL水中。5.1.2配制：将上述试剂加热溶解，调节pH至7.2～7.4，分装试管或三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却备用。5.2无菌生理盐水（0.85%）称取8.5g氯化钠溶于1000mL水中，121℃高压蒸汽灭菌15min，备用。5.3稀释水样用无菌水实验用水经121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却备用。6仪器和设备6.1恒温培养箱：可控温度36℃±2℃。6.2高压蒸汽灭菌器：工作压力0.1MPa、温度121℃。6.3无菌操作台/生物安全柜。6.4无菌平皿：直径90mm。6.5无菌移液管、无菌吸管、无菌三角瓶、试管等玻璃器皿。6.6菌落计数器。7样品7.1样品采集按照HJ/T91、HJ/T164规范要求采集水样，采用无菌容器采样，采样过程严格无菌操作，避免交叉污染。7.2样品保存样品采集后避光、冷藏（0℃～4℃）保存，严格按照HJ493执行，采样后4h内完成测定，不得冷冻保存。8分析步骤8.1实验准备实验前开启无菌操作台紫外灯灭菌30min，所有器皿、培养基、稀释液均经高压灭菌处理，确认无菌后方可使用。8.2水样稀释8.2.1充分混匀水样，根据水样污染程度选择适宜稀释倍数。清洁水样可直接取样不稀释；污染较重水样采用10倍递增稀释法。8.2.2每个水样至少设置2～3个适宜稀释度，每个稀释度做2个平行平皿。8.3接种与倾注平板8.3.1用无菌吸管准确吸取1.0mL混匀水样（或稀释水样）注入无菌平皿中。8.3.2将冷却至45℃±5℃的营养琼脂培养基约15mL倾注至平皿中，轻轻转动平皿，使水样与培养基充分混匀，静置待凝固。8.3.3同时做空白对照：取1.0mL无菌水同步倾注平板，操作步骤完全一致。8.4培养待平板培养基完全凝固后，倒置平板，放入36℃±2℃恒温培养箱，培养48h±2h。8.5菌落计数8.5.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间的平板作为计数标准平板。8.5.2统计每个合格平板菌落数，计算同一稀释度两个平行平板的平均菌落数。9结果计算与表示9.1结果计算细菌总数计算公式如下：N=式中：N——水样中细菌总数，CFU/mL；C——所选平板平均菌落数，CFU；V——接种水样体积，mL；D——稀释倍数。9.2特殊情况处理9.2.1所有稀释度平均菌落数均在30CFU以下：取最低稀释度计算结果。9.2.2所有稀释度平均菌落数均在300CFU以上：取最高稀释度计算结果。9.2.3所有平板均无菌落生长：结果报“未检出”。9.2.4若仅有一个稀释度菌落数在30～300之间，直接计算；若两个稀释度均在范围内，按有效数字规则择优计算。9.3结果表示测定结果保留两位有效数字；数值≥100CFU/mL时采用科学计数法表示；结果单位为CFU/mL。平行样品结果取几何平均值。10质量保证与质量控制10.1全程无菌操作，操作台、器皿、培养基灭菌合格，空白对照平板不得检出菌落。10.2水样采样后4h内完成检测，严禁超时检测。10.3每个稀释度必须做平行样，平行样品菌落数相对偏差符合微生物检测质控要求。10.4培养基pH、培养温度、培养时间严格按标准管控，不得随意更改参数。10.5定期开展培养基有效性验证、空白核查、平行样质控核查。11精密度六家实验室对低、中、高三种浓度实际水样进行精密度测试：实验室内相对标准偏差：3.2%～12.5%；实验室间相对标准偏差：5.8%～18.2%；重复性限、再现性限满足日常水质微生物检测质控要求。附录A（资料性附录）常见问题与操作提示A.1水样浑浊、含杂质不影响本方法检测结果，正常稀释接种即可。A.2培