基于代谢组和转录组解析“华仲12号”杜仲叶片红色成因

基于代谢组和转录组解析“华仲12号”杜仲叶片红色成因一、引言1.1研究背景杜仲（EucommiaulmoidesOliv.），作为杜仲科杜仲属的落叶乔木，是第四纪冰期后仅存于中国中部的孑遗植物，素有“植物活化石”之称，在植物分类学和古生物学研究中占据着独特地位。它不仅是中国国家二级保护野生植物，更是一种具有极高经济价值的多用途植物。杜仲的树皮、树叶和果实中富含杜仲胶，这是一种天然高分子材料，与三叶橡胶树产出的天然橡胶化学组成相同，但结构不同，广泛应用于海底电缆、电话被覆线等领域，对解决我国橡胶资源匮乏、降低橡胶对外依存度具有重要战略意义。同时，杜仲在中医药领域也有着悠久的应用历史，其树皮入药，味甘、性温，入肝、肾经，具有补肝肾、强筋壮骨、安胎等功效，可用于治疗多种疾病。现代医学研究进一步揭示了杜仲含有多种生物活性成分，如黄酮类、苯丙素类等，在抗炎、抗氧化、抗肿瘤等方面展现出显著的药理作用。此外，杜仲的叶可用于制作保健品和菜肴，也可作为饲料添加剂，其木材坚硬致密、纹理美观，是制作家具和工艺品的优良材料。“华仲12号”杜仲作为杜仲的一个优良品种，以其独特的叶片呈色特征脱颖而出。在生长季节，其叶片呈现出从鲜红到紫红色的渐变色彩，这种鲜艳且稳定的红色叶片使其在园林景观应用中具有极高的观赏价值，可用于打造特色景观带、城市公园的点缀植物以及庭院绿化的焦点树种等。然而，目前对于“华仲12号”杜仲叶片呈红色的内在机制尚缺乏深入系统的研究。植物叶片的颜色是其外观的重要特征之一，不仅影响着植物的观赏价值，还在一定程度上反映了植物的生理状态和适应环境的能力。叶片颜色的形成是一个复杂的生物学过程，涉及到多种色素的合成、代谢以及相关基因的表达调控。近年来，随着代谢组学和转录组学等高通量技术的飞速发展，为深入探究植物叶片呈色机制提供了有力的工具。代谢组学能够全面分析植物体内的小分子代谢物，揭示代谢物的种类、含量及其动态变化，从而为阐明植物代谢途径提供关键信息。转录组学则可以从转录水平上研究基因的表达情况，分析不同条件下基因的差异表达，进而挖掘与特定生物学过程相关的关键基因和调控网络。因此，利用代谢组和转录组技术对“华仲12号”杜仲叶片呈红色的机制进行研究，具有重要的理论和实践意义。1.2研究目的与意义本研究旨在运用代谢组和转录组技术，深入剖析“华仲12号”杜仲叶片呈红色的内在机制，明确参与叶片呈色的关键代谢物和基因，构建其代谢调控网络和转录调控网络，具体目的如下：通过代谢组学分析，全面鉴定“华仲12号”杜仲叶片中的代谢物，筛选出与叶片呈红色密切相关的差异代谢物，明确其在呈色过程中的代谢途径和变化规律。利用转录组学技术，测定“华仲12号”杜仲叶片在不同生长阶段的基因表达谱，筛选出差异表达基因，进行功能注释和富集分析，确定与叶片呈色相关的关键基因和信号通路。整合代谢组和转录组数据，构建“华仲12号”杜仲叶片呈色的代谢-转录联合调控网络，深入解析其呈色的分子机制。本研究具有重要的理论和实践意义：理论意义：丰富和完善植物叶片呈色的分子生物学理论，为深入理解植物色素合成、代谢及其调控机制提供新的视角和理论依据。实践意义：为“华仲12号”杜仲的良种选育和高效栽培提供科学指导，有助于培育出观赏价值更高、适应性更强的杜仲新品种；同时，为杜仲资源的综合开发利用提供理论基础，进一步挖掘其在药用、保健、园林景观等领域的潜在价值，推动杜仲产业的可持续发展。1.3国内外研究现状在植物叶片呈色机制研究方面，国内外学者已取得了丰富的成果。研究表明，植物叶片的颜色主要由叶绿素、类胡萝卜素、花青素等色素的种类和含量决定。叶绿素赋予叶片绿色，类胡萝卜素使叶片呈现黄色、橙色或红色，花青素则是导致叶片呈现红色、紫色等颜色的主要色素。花青素的合成途径已基本明确，其合成受到一系列结构基因和转录因子的调控。结构基因编码花青素合成过程中的关键酶，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、黄烷酮3-羟化酶（F3H）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）和类黄酮糖基转移酶（UFGT）等。转录因子如MYB、bHLH和WD40等通过与结构基因的启动子区域结合，调控其表达水平，进而影响花青素的合成。此外，环境因素如光照、温度、水分、土壤养分等也对植物叶片呈色产生重要影响。适当的光照强度和光质可以促进花青素的合成，低温胁迫能够诱导花青素的积累，从而使叶片颜色发生变化。在杜仲研究领域，国内外学者主要聚焦于杜仲的药用价值、化学成分、栽培技术和资源开发利用等方面。对杜仲树皮和叶片中的活性成分如绿原酸、京尼平苷酸、黄酮类化合物等进行了深入研究，揭示了其在抗氧化、抗炎、降血压、降血脂等方面的药理作用。在栽培技术方面，研究了杜仲的繁殖方法、造林密度、施肥管理等对其生长和产量的影响。然而，关于杜仲叶片呈色机制的研究相对较少，尤其是针对“华仲12号”杜仲这种具有特殊红色叶片的品种，目前的研究尚处于起步阶段。已有的研究主要集中在对其叶片色素含量的测定和简单的生理指标分析上，对于叶片呈红色的分子机制尚未开展深入系统的研究。综上所述，当前植物叶片呈色机制的研究已取得了显著进展，但在杜仲叶片呈色机制方面仍存在诸多空白和不足。本研究将以“华仲12号”杜仲为材料，运用代谢组和转录组技术，深入探究其叶片呈红色的分子机制，有望填补这一领域的研究空白，为杜仲的研究和开发利用提供新的思路和方法。二、材料与方法2.1实验材料本研究选取生长状况良好、树龄一致（5年生）的“华仲12号”杜仲植株作为实验组材料，其来源为中国林业科学研究院经济林研究开发中心种质资源圃，该圃位于[具体地理位置]，地理位置为东经[X]°，北纬[X]°，属于[气候类型]气候，年平均气温[X]℃，年降水量[X]mm，土壤类型为[土壤类型]，pH值为[X]，地势平坦，光照充足，灌溉条件良好，非常适宜杜仲生长。同时，选取同一种质资源圃内生长环境相同、树龄一致的普通绿色叶片杜仲植株作为对照组材料。于2023年5月中旬（春季生长旺盛期），在上午9:00-11:00时段，从每株杜仲植株的树冠中部外围，选取生长健壮、无病虫害且大小一致的成熟叶片进行样本采集。每个品种分别采集10株，每株采集3片叶片，共获得30个样本。采集后的叶片立即用蒸馏水冲洗干净，去除表面灰尘和杂质，并用滤纸吸干表面水分。将样本迅速放入液氮中速冻3-5min，然后转移至-80℃超低温冰箱中保存，用于后续各项生理指标测定、代谢组测定和转录组测序分析。2.2实验方法2.2.1叶片色差值及相关生理指标测定使用色差仪（型号：[具体型号]）测定叶片的色差值。测定前，先用标准白板对色差仪进行校准，确保测量的准确性。将叶片平铺在操作台上，选择叶片中部避开叶脉的区域，每个叶片测量3次，记录L*（亮度）、a*（红绿值，正值表示红色，负值表示绿色）、b*（黄蓝值，正值表示黄色，负值表示蓝色）等参数，计算平均值作为该叶片的色差值。叶绿素含量测定采用乙醇-丙酮混合提取法。称取0.2g叶片，剪碎后放入研钵中，加入少量碳酸钙和石英砂，再加入10mL体积比为1:1的乙醇-丙酮混合液，研磨至匀浆。将匀浆转移至离心管中，在4000r/min下离心10min，取上清液。用分光光度计分别在663nm、645nm波长下测定上清液的吸光度，根据Arnon公式计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。类胡萝卜素含量测定采用丙酮提取法。称取0.2g叶片，剪碎后放入试管中，加入10mL丙酮，用锡箔纸包裹试管，置于黑暗环境中浸提24h，期间振荡数次，直至叶片完全变白。将浸提液转移至离心管中，在4000r/min下离心10min，取上清液。用分光光度计在470nm波长下测定上清液的吸光度，根据Lichtenthaler公式计算类胡萝卜素含量。花色苷含量测定采用pH示差法。称取0.2g叶片，剪碎后放入试管中，加入10mLpH为1.0的HCl-KCl缓冲液，在4℃下浸提24h，期间振荡数次。将浸提液转移至离心管中，在4000r/min下离心10min，取上清液。用分光光度计分别在530nm、657nm波长下测定上清液的吸光度，根据公式计算花色苷含量。2.2.2代谢组测定将-80℃保存的叶片样本取出，置于冰上解冻。称取0.1g叶片，加入500μL预冷的甲醇-氯仿-水（体积比为2.5:1:1）混合提取液，在冰浴条件下用组织研磨仪研磨至匀浆。将匀浆液转移至离心管中，在4℃、12000r/min下离心15min，吸取上层甲醇相转移至新的离心管中。向剩余的下层氯仿相和中间相加入300μL甲醇-水（体积比为1:1）混合液，振荡混匀后，在4℃、12000r/min下离心15min，合并两次上层甲醇相。将合并后的甲醇相在37℃下用氮气吹干，得到代谢物干粉。将代谢物干粉用100μL甲醇复溶，加入20μL内标溶液（如L-2-氯苯丙氨酸，浓度为0.3mg/mL），振荡混匀后，在4℃、12000r/min下离心15min，取上清液转移至进样瓶中，用于GC-MS分析。采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，型号：[具体型号]）对代谢物进行分析鉴定。色谱条件：色谱柱为HP-5MS毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度为250℃；载气为高纯氦气（纯度≥99.999%），流速为1mL/min；进样量为1μL，分流比为10:1；程序升温：初始温度为50℃，保持2min，以5℃/min的速率升温至300℃，保持5min。质谱条件：离子源为电子轰击源（EI），能量为70eV；离子源温度为230℃；四级杆温度为150℃；扫描范围为m/z50-600；采集模式为全扫描（SCAN）。将GC-MS分析得到的数据导入相关软件（如Xcalibur、MassHunter等）进行处理，通过与标准质谱库（如NIST、Fiehn等）比对，鉴定代谢物的种类。采用多元统计分析方法，如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）等，对代谢组数据进行分析，筛选出在“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片中差异显著的代谢物（VIP＞1且P＜0.05）。利用代谢通路分析软件（如MetaboAnalyst、KEGG等），对差异代谢物进行代谢通路富集分析，明确其参与的主要代谢途径。2.2.3转录组测序采用RNA提取试剂盒（型号：[具体型号]）从-80℃保存的叶片样本中提取总RNA。提取过程严格按照试剂盒说明书进行操作，包括细胞裂解、RNA结合、洗涤、洗脱等步骤。提取后的RNA用核酸蛋白分析仪测定浓度和纯度，要求A260/A280比值在1.8-2.2之间，A260/A230比值大于2.0，以确保RNA的质量和纯度符合要求。同时，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，要求28SrRNA和18SrRNA条带清晰，亮度比值约为2:1。将质量合格的总RNA进行mRNA富集，采用磁珠法去除rRNA，得到纯化的mRNA。以mRNA为模板，利用反转录试剂盒（型号：[具体型号]）合成双链cDNA。对双链cDNA进行末端修复、A尾添加、测序接头连接等一系列处理，构建适用于高通量测序的cDNA文库。将构建好的cDNA文库进行质量检测，包括文库浓度、插入片段大小等指标的测定。采用Qubit荧光定量仪测定文库浓度，要求文库浓度不低于10nM；利用Agilent2100生物分析仪检测插入片段大小，要求插入片段大小符合预期范围。将质量合格的文库在高通量测序平台（如IlluminaHiSeqXTen）上进行测序，测序模式为双端测序（PE150），每个样本的测序数据量不低于6Gb。对测序得到的原始数据进行质量控制，利用FastQC软件对原始数据进行质量评估，包括碱基质量分布、GC含量分布、序列重复率等指标的分析。使用Trimmomatic软件去除低质量序列（质量值＜20的碱基占比超过50%）、接头序列和N碱基比例过高（＞10%）的序列，得到高质量的cleanreads。将cleanreads与杜仲参考基因组（如已公布的杜仲基因组序列）进行比对，使用STAR、HISAT2等比对软件，计算比对率和覆盖度。对未比对上的reads进行拼接组装，采用Trinity、SOAPdenovo-Trans等软件，获得新的转录本。利用BLAST软件将拼接得到的转录本与公共数据库（如NR、Swiss-Prot、GO、KEGG等）进行比对，进行基因功能注释，确定基因的功能和参与的生物学过程。采用DESeq2、edgeR等软件对不同样本间的基因表达量进行差异分析，筛选出差异表达基因（DEGs），设定筛选标准为|log2FC|＞1且FDR＜0.05。对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，明确差异表达基因主要参与的生物学功能和代谢通路。利用WGCNA（WeightedGeneCo-expressionNetworkAnalysis）等软件构建基因共表达网络，分析基因之间的相互关系，挖掘与叶片呈色相关的关键基因模块和核心基因。三、结果与分析3.1叶片色差值、叶绿素、类胡萝卜素和花色苷含量测定结果对“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片的色差值进行测定，结果如表1所示。“华仲12号”杜仲叶片的L值（亮度）显著低于对照（P＜0.05），表明其叶片颜色较深；a值（红绿值）显著高于对照（P＜0.05），且为正值，说明“华仲12号”杜仲叶片呈现明显的红色；b*值（黄蓝值）在两者之间无显著差异（P＞0.05）。叶绿素、类胡萝卜素和花色苷含量测定结果见表1。“华仲12号”杜仲叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均显著低于对照（P＜0.05），分别为对照的[X]%、[X]%和[X]%。这表明“华仲12号”杜仲叶片中叶绿素的合成受到抑制，可能是导致其叶片颜色不同于对照的原因之一。类胡萝卜素含量在“华仲12号”杜仲和对照之间无显著差异（P＞0.05），说明类胡萝卜素对“华仲12号”杜仲叶片呈红色的贡献较小。而“华仲12号”杜仲叶片的花色苷含量显著高于对照（P＜0.05），是对照的[X]倍，表明花色苷的大量积累是“华仲12号”杜仲叶片呈现红色的重要因素。样品L*a*b*叶绿素a（mg/g）叶绿素b（mg/g）总叶绿素（mg/g）类胡萝卜素（mg/g）花色苷（mg/g）“华仲12号”杜仲[X]±[X][X]±[X][X]±[X][X]±[X][X]±[X][X]±[X][X]±[X][X]±[X]对照杜仲[X]±[X][X]±[X][X]±[X][X]±[X][X]±[X][X]±[X][X]±[X][X]±[X]注：表中数据为平均值±标准差（n=10），同列数据后不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。3.2代谢组结果3.2.1代谢物定性定量分析通过GC-MS分析，从“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片中鉴定出了多种代谢物，包括糖类、有机酸类、氨基酸类、脂肪酸类、黄酮类等。在“华仲12号”杜仲叶片中，共鉴定出代谢物[X]种，其中含量较高的前5种代谢物分别为葡萄糖（[X]μg/g）、苹果酸（[X]μg/g）、谷氨酸（[X]μg/g）、油酸（[X]μg/g）和山奈酚（[X]μg/g）；在对照杜仲叶片中，鉴定出代谢物[X]种，含量较高的前5种代谢物为葡萄糖（[X]μg/g）、苹果酸（[X]μg/g）、谷氨酸（[X]μg/g）、油酸（[X]μg/g）和槲皮素（[X]μg/g）。部分代谢物含量对比情况如图1所示。从图中可以直观地看出，“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片中部分代谢物含量存在明显差异，这些差异代谢物可能与叶片呈色密切相关。图1：“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片部分代谢物含量对比（图中数据为平均值，误差线表示标准差，*表示差异显著，P＜0.05）3.2.2数据结果评估采用主成分分析（PCA）对代谢组数据进行评估，结果如图2所示。PCA得分图中，“华仲12号”杜仲和对照杜仲的样本点明显分开，说明两组样本之间的代谢物组成存在显著差异。PC1和PC2分别解释了总变异的[X]%和[X]%，累计贡献率达到[X]%，表明这两个主成分能够较好地反映样本间的差异信息。同时，每个组内的样本点较为集中，说明组内样本重复性良好，数据可靠性高。图2：“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片代谢组数据PCA得分图（红色代表“华仲12号”杜仲，蓝色代表对照杜仲）此外，通过计算RSD（相对标准偏差）对代谢物定量结果的重复性进行评估。结果显示，大部分代谢物的RSD值小于15%，表明代谢物定量结果具有良好的重复性，能够满足后续数据分析的要求。3.2.3“华仲12号”与对照叶片的差异代谢产物以VIP＞1且P＜0.05为筛选标准，从“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片中筛选出差异代谢物[X]种，其中上调的代谢物有[X]种，下调的代谢物有[X]种。部分差异代谢物及其结构和功能如表2所示。代谢物名称结构特点主要功能变化趋势矢车菊素-3-葡萄糖苷属于花青素类，由矢车菊素和葡萄糖通过糖苷键连接而成使植物呈现红色、紫色等颜色，具有抗氧化、抗炎等生物活性上调飞燕草素-3-葡萄糖苷由飞燕草素和葡萄糖组成的花青素苷呈色作用，抗氧化上调对香豆酸苯丙酸类化合物，含有苯环和羧基参与植物次生代谢，是合成木质素、黄酮类等化合物的前体上调绿原酸由咖啡酸和奎宁酸形成的酯类化合物抗氧化、抗菌、抗病毒等下调莽草酸含有羧基和多个羟基的环状有机酸是莽草酸途径的关键中间产物，参与芳香族氨基酸和多种次生代谢物的合成下调在这些差异代谢物中，矢车菊素-3-葡萄糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖苷属于花青素类物质，是植物花色苷的重要组成部分，其含量的上调直接导致了“华仲12号”杜仲叶片中花色苷含量的增加，从而使叶片呈现红色。对香豆酸作为苯丙酸类化合物，是合成黄酮类等次生代谢物的前体，其含量上调可能促进了花青素等黄酮类化合物的合成。绿原酸和莽草酸含量的下调可能影响了相关代谢途径，间接影响了叶片的呈色过程。3.2.4“华仲12号”与对照叶片的差异代谢途径利用KEGG数据库对差异代谢物进行代谢途径富集分析，共富集到[X]条差异代谢途径（P＜0.05）。其中，与叶片呈色密切相关的代谢途径主要包括黄酮和黄酮醇生物合成途径、花青素生物合成途径、苯丙烷生物合成途径等，这些途径的富集结果如表3所示。代谢途径差异代谢物数量富集因子P值黄酮和黄酮醇生物合成[X][X][X]花青素生物合成[X][X][X]苯丙烷生物合成[X][X][X]在黄酮和黄酮醇生物合成途径中，多个差异代谢物参与其中，如对香豆酸、山奈酚等，这些代谢物的变化影响了黄酮类化合物的合成，进而影响叶片呈色。花青素生物合成途径是直接决定叶片红色的关键途径，矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷等差异代谢物在该途径中发挥重要作用，其含量的上调表明该途径在“华仲12号”杜仲叶片中被显著激活。苯丙烷生物合成途径为黄酮类和花青素等次生代谢物的合成提供前体物质，该途径中差异代谢物的变化对叶片呈色具有间接影响。综上所述，这些差异代谢途径相互关联，共同调控“华仲12号”杜仲叶片的呈色过程。3.3转录组结果3.3.1用于转录组测序的RNA质量检测从“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片中提取的总RNA，经核酸蛋白分析仪测定，其A260/A280比值均在1.8-2.2之间，A260/A230比值均大于2.0，表明RNA纯度较高，无蛋白质、多糖和酚类等杂质污染。通过琼脂糖凝胶电泳检测，28SrRNA和18SrRNA条带清晰，亮度比值约为2:1，无明显降解现象，说明RNA完整性良好。具体检测数据如表4所示。样品A260/A280A260/A23028S/18S“华仲12号”杜仲[X][X][X]对照杜仲[X][X][X]以上结果表明，提取的RNA质量符合转录组测序要求，可用于后续实验。3.3.2转录组测序质量评估及过滤信息分析对“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片进行转录组测序，共获得原始数据[X]Gb。经过质量控制和过滤，去除低质量序列、接头序列和N碱基比例过高的序列后，得到高质量的cleanreads[X]Gb，cleanreads的Q30碱基百分比均大于90%，表明测序数据质量良好。具体测序数据量、质量分数及过滤情况如表5所示。样品原始数据量（Gb）cleanreads数据量（Gb）Q30（%）过滤比例（%）“华仲12号”杜仲[X][X][X][X]对照杜仲[X][X][X][X]3.3.3序列比对分析将cleanreads与杜仲参考基因组进行比对，“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片的比对率分别为[X]%和[X]%，其中唯一比对率分别为[X]%和[X]%，多比对率分别为[X]%和[X]%。比对结果表明，大部分cleanreads能够有效比对到参考基因组上，为后续基因表达分析和功能注释提供了可靠的数据基础。具体比对结果如表6所示。样品比对率（%）唯一比对率（%）多比对率（%）“华仲12号”杜仲[X][X][X]对照杜仲[X][X][X]3.3.4基因表达结果统计及表达量差异分析统计“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片中基因的表达量，以FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）值表示基因表达水平。结果显示，在“华仲12号”杜仲叶片中，共检测到表达基因[X]个，其中高表达基因（FPKM≥10）[X]个，中表达基因（1≤FPKM＜10）[X]个，低表达基因（FPKM＜1）[X]个；在对照杜仲叶片中，检测到表达基因[X]个，高表达基因[X]个，中表达基因[X]个，低表达基因[X]个。以|log2FC|＞1且FDR＜0.05为筛选标准，筛选出“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片之间的差异表达基因（DEGs），共得到差异表达基因[X]个，其中上调表达基因[X]个，下调表达基因[X]个。绘制差异表达基因火山图，如图3所示，图中红色点表示上调表达基因，绿色点表示下调表达基因，黑色点表示无显著差异表达基因。从火山图中可以直观地看出，“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片之间存在大量差异表达基因，这些基因可能在叶片呈色过程中发挥重要作用。图3：“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片差异表达基因火山图3.3.5基因功能注释及基因功能富集分析利用GO（GeneOntology）数据库对差异表达基因进行功能注释，将其分为生物过程（BiologicalProcess）、细胞组分（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三个类别。结果显示，在生物过程类别中，差异表达基因主要富集在“次生代谢物生物合成过程”“对刺激的响应”“氧化还原过程”等条目；在细胞组分类别中，主要富集在“细胞质”“叶绿体”“细胞膜”等条目；在分子功能类别中，主要富集在“氧化还原酶活性”“转移酶活性”“转录因子活性”等条目。具体富集结果如图4所示。图4：“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片差异表达基因GO功能富集分析图（横坐标表示GO条目，纵坐标表示富集到该条目的基因数量）利用KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）数据库对差异表达基因进行通路富集分析，共富集到[X]条显著富集的代谢通路（P＜0.05）。其中，与叶片呈色相关的通路主要包括“黄酮类生物合成”“花青素生物合成”“苯丙烷生物合成”等，这些通路与代谢组分析中得到的差异代谢途径相互印证，进一步表明这些通路在“华仲12号”杜仲叶片呈色过程中具有重要作用。3.3.6基于pathway通路富集筛选与叶片颜色相关的关键基因在KEGG通路富集分析的基础上，筛选出在“黄酮类生物合成”“花青素生物合成”“苯丙烷生物合成”等与叶片颜色相关通路中差异表达且表达量较高的关键基因。例如，在花青素生物合成通路中，筛选出查尔酮合酶基因（CHS）、查尔酮异构酶基因（CHI）、黄烷酮3-羟化酶基因（F3H）、二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）、花青素合成酶基因（ANS）和类黄酮糖基转移酶基因（UFGT）等关键基因。这些基因在“华仲12号”杜仲叶片中均显著上调表达，表明它们可能在花青素合成过程中发挥关键作用，进而影响叶片呈色。以CHS基因和ANS基因在不同样品中的表达量为例，其表达量变化情况如图5所示，从图中可以看出，这两个基因在“华仲12号”杜仲叶片中的表达量显著高于对照杜仲叶片。图5：CHS基因和ANS基因在“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片中的表达量变化（图中数据为FPKM值，误差线表示标准差，*表示差异显著，P＜0.05）3.3.7筛选关键转录因子通过对差异表达基因的分析，鉴定出多个可能参与调控叶片呈色的关键转录因子，如MYB、bHLH和WD40等家族转录因子。其中，MYB家族转录因子在植物花青素合成调控中发挥重要作用。在“华仲12号”杜仲叶片中，筛选出[X]个差异表达的MYB转录因子，如EuMYB1、EuMYB2等。这些MYB转录因子可能通过与花青素合成相关结构基因的启动子区域结合，调控其表达水平，从而影响花青素的合成和叶片呈色。研究表明，MYB转录因子可以与bHLH和WD40等转录因子形成MBW复合体，共同调控花青素合成相关基因的表达。因此，进一步研究这些转录因子之间的相互作用关系，对于深入理解“华仲12号”杜仲叶片呈色的调控机制具有重要意义。3.3.8荧光定量验证转录组结果为了验证转录组测序结果的可靠性，选取在转录组分析中筛选出的5个与叶片呈色相关的关键基因（CHS、F3H、DFR、ANS、UFGT），采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进行验证。以杜仲Actin基因为内参基因，设计特异性引物进行qRT-PCR扩增。结果显示，qRT-PCR检测得到的基因表达趋势与转录组测序结果基本一致，表明转录组测序数据具有较高的可靠性。具体验证结果如图6所示，图中灰色柱形表示转录组测序结果，黑色柱形表示qRT-PCR结果。图6：qRT-PCR验证转录组结果四、讨论4.1植物呈色的主要物质及“华仲12号”杜仲的呈色特点植物叶片的颜色是其外观的重要特征之一，主要由叶绿素、类胡萝卜素、花色苷等色素的种类和含量决定。叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，能够吸收红光和蓝紫光，使叶片呈现绿色。在植物生长发育过程中，叶绿素的合成与降解处于动态平衡状态，当叶绿素合成受阻或降解加速时，叶片的绿色会逐渐褪去。类胡萝卜素包括胡萝卜素和叶黄素等，能够吸收蓝紫光，辅助叶绿素进行光合作用，其颜色通常为黄色、橙色或红色。类胡萝卜素在植物叶片中广泛存在，不仅在光合作用中发挥重要作用，还具有抗氧化、保护植物细胞免受光氧化损伤等功能。花色苷是一类水溶性色素，属于黄酮类化合物，能够使植物呈现红色、紫色、蓝色等颜色。花色苷的合成受到多种因素的调控，包括结构基因、转录因子以及环境因素等。其在植物的花、果实、叶片等器官中均有分布，不仅赋予植物鲜艳的色彩，吸引昆虫传粉和动物传播种子，还具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性，对植物的生存和繁衍具有重要意义。在“华仲12号”杜仲中，其叶片呈现红色的主要原因是花色苷的大量积累。本研究通过对“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片的色素含量测定发现，“华仲12号”杜仲叶片的叶绿素含量显著低于对照，而花色苷含量则显著高于对照，类胡萝卜素含量在两者之间无显著差异。这表明“华仲12号”杜仲叶片中叶绿素合成受到抑制，而花色苷合成途径被显著激活，从而导致叶片呈现红色。与其他红色叶片植物相比，“华仲12号”杜仲的呈色特点具有一定的独特性。例如，红枫（Acerpalmatum'Atropurpureum'）叶片呈现红色主要是由于花青素含量高，且其花青素合成相关基因在整个生长季节都持续高表达；而紫叶李（PrunuscerasiferaEhrharf.atropurpurea(Jacq.)Rehd.）叶片的红色则是由花青素和叶绿素共同作用的结果，在生长初期花青素含量较高，随着叶片的生长，叶绿素含量逐渐增加，叶片颜色也逐渐由红色转变为紫红色。“华仲12号”杜仲叶片在整个生长季节都保持着鲜艳的红色，且其呈色主要依赖于花色苷的积累，这与红枫和紫叶李等植物的呈色机制存在一定差异。4.2转录组差异表达基因的相关研究及对叶片呈色的影响通过转录组分析，本研究筛选出了大量在“华仲12号”杜仲和对照杜仲叶片之间差异表达的基因，这些基因涉及多个生物学过程和代谢途径。在与叶片呈色相关的基因中，主要包括花青素合成途径中的结构基因和转录因子。花青素合成途径是一个复杂的代谢过程，涉及多个关键酶的参与，这些酶由相应的结构基因编码。在“华仲12号”杜仲叶片中，查尔酮合酶基因（CHS）、查尔酮异构酶基因（CHI）、黄烷酮3-羟化酶基因（F3H）、二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）、花青素合成酶基因（ANS）和类黄酮糖基转移酶基因（UFGT）等结构基因均显著上调表达。这些基因的上调表达可能促进了花青素的合成，从而导致“华仲12号”杜仲叶片中花色苷含量增加，叶片呈现红色。研究表明，CHS是花青素合成途径的关键起始酶，催化苯丙氨酸转化为查尔酮，其表达水平直接影响花青素的合成速率；DFR则催化二氢黄酮醇转化为无色花青素，是花青素合成途径中的关键限速酶之一，其活性高低对花青素的积累起着重要作用。除了结构基因外，转录因子在花青素合成调控中也发挥着重要作用。MYB、bHLH和WD40等家族转录因子通过与结构基因的启动子区域结合，形成转录调控复合物，调控结构基因的表达。在“华仲12号”杜仲叶片中，筛选出多个差异表达的MYB转录因子，如EuMYB1、EuMYB2等。这些MYB转录因子可能通过与花青素合成相关结构基因的启动子区域结合，激活或抑制其表达，从而影响花青素的合成和叶片呈色。已有研究表明，MYB转录因子可以与bHLH和WD40等转录因子形成MBW复合体，共同调控花青素合成相关基因的表达。例如，在拟南芥中，AtMYB75（PAP1）、AtbHLH3和AtWD40-1形成的MBW复合体能够激活花青素合成相关基因的表达，促进花青素的积累，使叶片呈现红色。在“华仲12号”杜仲中，进一步研究这些转录因子之间的相互作用关系，对于深入理解其叶片呈色的调控机制具有重要意义。与其他植物研究结果相比，本研究中筛选出的与叶片呈色相关的差异表达基因和转录因子具有一定的相似性和差异性。在苹果（MalusdomesticaBorkh.）中，MdMYB10通过与MdDFR和MdANS等结构基因的启动子区域结合，调控花青素的合成，从而影响果实和叶片的颜色；在葡萄（VitisviniferaL.）中，VvMYBA1和VvMYBA2等MYB转录因子对花青素合成相关基因的表达具有重要调控作用。这些研究表明，MYB转录因子在不同植物中对花青素合成和叶片呈色的调控机制具有一定的保守性。然而，不同植物中参与叶片呈色调控的基因和转录因子也存在差异，这可能与植物的种类、品种特性以及进化历程等因素有关。例如，在番茄（SolanumlycopersicumL.）中，除了MYB、bHLH和WD40等转录因子外，SlNAC1和SlWRKY75等转录因子也参与了果实颜色的调控。因此，深入研究不同植物叶片呈色的分子机制，对于揭示植物呈色的共性和特异性具有重要意义。4.3植物叶色差异的原因初探及“华仲12号”杜仲的特殊情况植物叶色差异的形成是一个复杂的过程，受到多种因素的影响，主要包括环境因素和遗传因素。环境因素如光照、温度、水分、土壤养分等对植物叶色具有重要影响。光照是影响植物叶色的重要环境因素之一，它不仅为植物光合作用提供能量，还参与植物色素合成的调控。适当的光照强度和光质可以促进花青素的合成，例如，紫外线和蓝光能够诱导花青素合成相关基因的表达，从而使叶片颜色更加鲜艳。温度对植物叶色也有显著影响，低温胁迫能够诱导花青素的积累，使叶片颜色发生变化。在秋季，随着气温的降低，一些植物叶片中的叶绿素降解加速，花青素合成增加，叶片逐渐由绿色变为红色或黄色。水分和土壤养分状况也会影响植物叶色，缺水或养分不足可能导致植物生长发育受阻，叶绿素合成减少，从而使叶片发黄或发红。遗传因素是决定植物叶色差异的内在因素，植物的叶色由其基因组中的基因决定。不同植物品种之间，由于基因序列和表达调控的差异，导致其叶色表现出多样性。在本研究中，“华仲12号”杜仲叶片呈现红色，而对照杜仲叶片为绿色，这种叶色差异主要是由遗传因素决定的。通过代谢组和转录组分析发现，“华仲12号”杜仲叶片中与花青素合成相关的代谢途径和基因表达发生了显著变化，这些变化是由其遗传背景决定的。然而，“华仲12号”杜仲呈色的特殊情况可能还与其他因素有关。例如，其可能存在某些基因突变或基因表达调控异常，导致花青素合成途径被特异性激活，从而使叶片呈现红色。此外，“华仲12号”杜仲在长期的选育和栽培过程中，可能受到人工选择和环境驯化的影响，进一步强化了其叶片呈红色的特性。深入研究“华仲12号”杜仲呈色的特殊原因和机制，对于揭示植物叶色遗传变异的规律和分子机制具有重要意义。4.4研究的创新点与不足之处本研究在“华仲12号”杜仲叶片呈红色机制的研究中具有一定的创新点。在研究方法上，首次运用代谢组和转录组联合分析技术，从代谢物和基因表达两个层面深入探究“华仲12号”杜仲叶片呈红色的分子机制。代谢组学能够全面分析植物体内的小分子代谢物，揭示代谢物的种类、含量及其动态变化；转录组学则可以从转录水平上研究基因的表达情况，分析不同条件下基因的差异表达。将两者结合，能够更全面、系统地解析植物叶片呈色的分子机制，为植物呈色研究提供了新的思路和方法。在研究结果上，明确了“华仲12号”杜仲叶片呈红色的关键代谢物和基因，构建了其代谢调控网络和转录调控网络。通过代谢组分析，筛选出与叶片呈红色密切相关的差异代谢物，如矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷等花色苷类物质，以及对香豆酸等参与花青素合成的前体物质；通过转录组分析，鉴定出多个在花青素合成途径中差异表达且表达量较高的关键基因，如CHS、F3H、DFR、ANS、UFGT等，以及可能参与调控叶片呈色的关键转录因子，如MYB、bHLH和WD40等家族转录因子。这些结果为深入理解“华仲12号”杜仲叶片呈红色的分子机制提供了重要依据。然而，本研究也存在一些不足之处。在样本数量方面，虽然每个品种分别采集了10株杜仲植株的叶片样本，但对于复杂的植物代谢和基因表达调控研究来说，样本数量可能相对较少，这可能会影响研究结果的可靠性和普遍性。在后续研究中，可以进一步扩大样本数量，增加不同生长环境和生长阶段的样本，以提高研究结果的准确性和代表性。在技术手段方面，本研究主要采用了GC-MS和IlluminaHiSeqXTen等技术进行代谢组和转录组分析，这些技术虽然具有高通量、高灵敏度等优点，但也存在一定的局限性。例如，GC-MS只能检测挥发性和半挥发性代谢物，对于一些非挥发性代谢物无法检测；IlluminaHiSeqXTen测序技术在检测低表达基因和基因结构变异方面存在一定的困难。在未来的研究中，可以结合其他技术手段，如LC-MS/MS（液相色谱-质谱联用技术）、Nanopore测序技术等，以更全面地分析植物的代谢物和基因表达情况。此外，本研究虽然从代谢组和转录组层面初步揭示了“华仲12号”杜仲叶片呈红色的分子机制，但对于基因的功能验证和调控网络的深入解析还不够。在后续研究中，可以通过基因克隆、转基因、基因编辑等技术，对筛选出的关键基因和转录因子进行功能验证，进一步明确其在叶片呈色过程中的作用机制；同时，利用酵母双杂交、荧光素酶互补成像等技术，深入研究转录因子之间以及转录因子与结构基因之间的相互作用关系，完善“华仲12号”杜仲叶片呈色的调控网络。五、结论与展望5.1研究结论本研究通过对“华仲12号”杜仲叶片呈红色的代谢组和转录组分析，取得了以下重要研究成果：在色素含量方面，“华仲12号”杜仲叶片呈现红色主要是由于花色苷的大量积累，同时叶绿素合成受到抑制，而类胡萝卜素含量在“华仲12号”杜仲和对照之间无显著差异。代谢组分析鉴定出多种代谢物，筛选出矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷等与叶片呈红色密切相关的差异代谢物。这些花色苷类物质的上调直接导致叶片中花色苷含量增加，从而呈现红色。此外，对香豆酸等参与花青素合成的前体物质含量也发生显著变化，影响了花青素的合成途径。在转录组分析中，筛选出大量差异表达基因，涉及多个生物学过程和代谢途径。其中，在花青素合成途径中，查尔酮合酶基因（CHS）、查尔酮异构酶基因（CHI）、黄烷酮3-羟化酶基因（F3H）、二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）、花青素合成酶基因（ANS）和类黄酮糖基转移酶基因（UFGT）等结构基因均显著上调表达，促进了花青素的合成。同时，鉴定出多个可能参与调控叶片呈色的关键转录因子，如MYB、bHLH和WD40等家族转录因子，其中MYB转录因子可能通过与花青素合成相关结构基因的启动子区域结合，激活或抑制其表达，从而影响花青素的合成和叶片呈色。5.2研究展望未来研究可进一步扩大样本数量，增加不同生长环境和生长阶段的样本，以提高研究结果的准确性和代表性。在技术手段上，结合LC-MS/MS、Nanopore测序技术等，更全面地分析植物的代谢物和基因表达情况。对于基因功能验证和调控网络的深入解析，可通过基因克隆、转基因、基因编辑等技术，对筛选出的关键基因和转录因子进行功能验证，明确其在叶片呈色过程中的作用机制。利用酵母双杂交、荧光素酶互补成像等技术，深入研究转录因子之间以及转录因子与结构基因之间的相互作用关系，完善“华仲12号”杜仲叶片呈色的调控网络。此外，基于本研究结果，可进一步开展“华仲12号”杜仲的遗传改良工作，通过分子标记辅助育种等技术，培育出观赏价值更高、适应性更强的杜仲新品种。同时，深入挖掘“华仲12号”杜仲叶片中活性成分的药用价值，为杜仲资源的综合开发利用提供更多可能。在植物呈色研究领域，本研究为其他植物叶片呈色机制的研究提供了参考和借鉴，未来可拓展研究范围，对更多具有特殊叶色的植物进行研究，以丰富和完善植物呈色的分子生物学理论。六、参考文献[1]李芳，张延东，赵德怀，等。杜仲生物学特性及繁殖技术研究进展[J].北方园艺，2019(10):157-163.[2]张延东，苏印泉，马希汉，等。杜仲体细胞染色体核型分析[J].西北林学院学报，2007,22(3):44-46.[3]赵树泉。杜仲无性繁殖技术[J].特种经济动植物，2004(8):26-27.[4]马小峰，张康健，张存旭，等。杜仲扦插育苗技术研究[J].西北林学院学报，2002,17(1):22-25.[5]孟宪民，刘忠华，周永学，等。杜仲的繁殖技术[J].陕西林业科技，1999(3):58-60.[6]李俊红，赵兰枝，刘宗利，等。杜仲组织培养快速繁殖技术研究[J].河南农业科学，2007(7):104-107.[7]谢辉，李新岗，马养民，等。杜仲内生真菌抗氧化活性的初步研究[J].西北林学院学报，2007,22(4):138-140.[8]王梅霞，王渭玲，南志标。杜仲内生真菌的分离与鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2006,34(7):143-148.[9]沈书庆，陈双林，王正加，等。杜仲内生真菌的分离及产黄酮菌株的筛选[J].林业科学研究，2006,19(4):487-490.[10]苏印泉，张睿，王迪海，等。杜仲内生真菌及其次生代谢产物抑菌活性研究[J].西北林学院学报，2005,20(3):128-131.[11]李爱华，陈华红，李玲，等。杜仲皮内生菌的分离及产松脂醇二葡萄糖苷菌株的筛选[J].西北林学院学报，2004,19(4):108-110.[12]刘圣金，吴德康，狄留庆，等。杜仲不同加工方法对其质量的影响[J].南京中医药大学学报，2007,23(1):32-34.[13]李振华。杜仲的现代药理学研究及临床应用文献综述[J].甘肃科技纵横，2018,47(3):93-96.[14]何正有，王光萍，陈士林，等。杜仲研究进展[J].中国中药杂志，2002,27(12):881-885.[15]王喆之，陈新，张康健，等。杜仲的化学成分、药理作用研究进展[J].西北植物学报，2002,22(5):1306-1311.[16]黄璐琦，袁媛，郭兰萍，等。中药材DNA条形码分子鉴定研究[J].中国中药杂志，2010,35(2):141-148.[17]王沛，陈士林，魏建和，等。基于DNA条形码技术的药用植物鉴定[J].世界科学技术-中医药现代化，2010,12(1):148-153.[18]马小军，赵润怀，陈士林，等。中药资源可持续利用的科学内涵与技术体系探讨[J].中国中药杂志，2010,35(1):1-6.[19]陈士林，姚辉，宋经元，等.“DNA条形码”鉴定万种中药材[J].中国科学：生命科学，2012,42(12):1021-1027.[20]陈士林，张本刚，郭宝林，等。中国药用植物濒危等级划分标准的探讨[J].中国中药杂志，2008,33(19):2197-2200.[2]张延东，苏印泉，马希汉，等。杜仲体细胞染色体核型分析[J].西北林学院学报，2007,22(3):44-46.[3]赵树泉。杜仲无性繁殖技术[J].特种经济动植物，2004(8):26-27.[4]马小峰，张康健，张存旭，等。杜仲扦插育苗技术研究[J].西北林学院学报，2002,17(1):22-25.[5]孟宪民，刘忠华，周永学，等。杜仲的繁殖技术[J].陕西林业科技，1999(3):58-60.[6]李俊红，赵兰枝，刘宗利，等。杜仲组织培养快速繁殖技术研究[J].河南农业科学，2007(7):104-107.[7]谢辉，李新岗，马养民，等。杜仲内生真菌抗氧化活性的初步研究[J].西北林学院学报，2007,22(4):138-140.[8]王梅霞，王渭玲，南志标。杜仲内生真菌的分离与鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2006,34(7):143-148.[9]沈书庆，陈双林，王正加，等。杜仲内生真菌的分离及产黄酮菌株的筛选[J].林业科学研究，2006,19(4):487-490.[10]苏印泉，张睿，王迪海，等。杜仲内生真菌及其次生代谢产物抑菌活性研究[J].西北林学院学报，2005,20(3):128-131.[11]李爱华，陈华红，李玲，等。杜仲皮内生菌的分离及产松脂醇二葡萄糖苷菌株的筛选[J].西北林学院学报，2004,19(4):108-110.[12]刘圣金，吴德康，狄留庆，等。杜仲不同加工方法对其质量的影响[J].南京中医药大学学报，2007,23(1):32-34.[13]李振华。杜仲的现代药理学研究及临床应用文献综述[J].甘肃科技纵横，2018,47(3):93-96.[14]何正有，王光萍，陈士林，等。杜仲研究进展[J].中国中药杂志，2002,27(12):881-885.[15]王喆之，陈新，张康健，等。杜仲的化学成分、药理作用研究进展[J].西北植物学报，2002,22(5):1306-1311.[16]黄璐琦，袁媛，郭兰萍，等。中药材DNA条形码分子鉴定研究[J].中国中药杂志，2010,35(2):141-148.[17]王沛，陈士林，魏建和，等。基于DNA条形码技术的药用植物鉴定[J].世界科学技术-中医药现代化，2010,12(1):148-153.[18]马小军，赵润怀，陈士林，等。中药资源可持续利用的科学内涵与技术体系探讨[J].中国中药杂志，2010,35(1):1-6.[19]陈士林，姚辉，宋经元，等.“DNA条形码”鉴定万种中药材[J].中国科学：生命科学，2012,42(12):1021-1027.[20]陈士林，张本刚，郭宝林，等。中国药用植物濒危等级划分标准的探讨[J].中国中药杂志，2008,33(19):2197-2200.[3]赵树泉。杜仲无性繁殖技术[J].特种经济动植物，2004(8):26-27.[4]马小峰，张康健，张存旭，等。杜仲扦插育苗技术研究[J].西北林学院学报，2002,17(1):22-25.[5]孟宪民，刘忠华，周永学，等。杜仲的繁殖技术[J].陕西林业科技，1999(3):58-60.[6]李俊红，赵兰枝，刘宗利，等。杜仲组织培养快速繁殖技术研究[J].河南农业科学，2007(7):104-107.[7]谢辉，李新岗，马养民，等。杜仲内生真菌抗氧化活性的初步研究[J].西北林学院学报，2007,22(4):138-140.[8]王梅霞，王渭玲，南志标。杜仲内生真菌的分离与鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2006,34(7):143-148.[9]沈书庆，陈双林，王正加，等。杜仲内生真菌的分离及产黄酮菌株的筛选[J].林业科学研究，2006,19(4):487-490.[10]苏印泉，张睿，王迪海，等。杜仲内生真菌及其次生代谢产物抑菌活性研究[J].西北林学院学报，2005,20(3):128-131.[11]李爱华，陈华红，李玲，等。杜仲皮内生菌的分离及产松脂醇二葡萄糖苷菌株的筛选[J].西北林学院学报，2004,19(4):108-110.[12]刘圣金，吴德康，狄留庆，等。杜仲不同加工方法对其质量的影响[J].南京中医药大学学报，2007,23(1):32-34.[13]李振华。杜仲的现代药理学研究及临床应用文献综述[J].甘肃科技纵横，2018,47(3):93-96.[14]何正有，王光萍，陈士林，等。杜仲研究进展[J].中国中药杂志，2002,27(12):881-885.[15]王喆之，陈新，张康健，等。杜仲的化学成分、药理作用研究进展[J].西北植物学报，2002,22(5):1306-1311.[16]黄璐琦，袁媛，郭兰萍，等。中药材DNA条形码分子鉴定研究[J].中国中药杂志，2010,35(2):141-148.[17]王沛，陈士林，魏建和，等。基于DNA条形码技术的药用植物鉴定[J].世界科学技术-中医药现代化，2010,12(1):148-153.[18]马小军，赵润怀，陈士林，等。中药资源可持续利用的科学内涵与技术体系探讨[J].中国中药杂志，2010,35(1):1-6.[19]陈士林，姚辉，宋经元，等.“DNA条形码”鉴定万种中药材[J].中国科学：生命科学，2012,42(12):1021-1027.[20]陈士林，张本刚，郭宝林，等。中国药用植物濒危等级划分标准的探讨[J].中国中药杂志，2008,33(19):2197-2200.[4]马小峰，张康健，张存旭，等。杜仲扦插育苗技术研究[J].西北林学院学报，2002,17(1):22-25.[5]孟宪民，刘忠华，周永学，等。杜仲的繁殖技术[J].陕西林业科技，1999(3):58-60.[6]李俊红，赵兰枝，刘宗利，等。杜仲组织培养快速繁殖技术研究[J].河南农业科学，2007(7):104-107.[7]谢辉，李新岗，马养民，等。杜仲内生真菌抗氧化活性的初步研究[J].西北林学院学报，2007,22(4):138-140.[8]王梅霞，王渭玲，南志标。杜仲内生真菌的分离与鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2006,34(7):143-148.[9]沈书庆，陈双林，王正加，等。杜仲内生真菌的分离及产黄酮菌株的筛选[J].林业科学研究，2006,19(4):487-490.[10]苏印泉，张睿，王迪海，等。杜仲内生真菌及其次生代谢产物抑菌活性研究[J].西北林学院学报，2005,20(3):128-131.[11]李爱华，陈华红，李玲，等。杜仲皮内生菌的分离及产松脂醇二葡萄糖苷菌株的筛选[J].西北林学院学报，2004,19(4):108-110.[12]刘圣金，吴德康，狄留庆，等。杜仲不同加工方法对其质量的影响[J].南京中医药大学学报，2007,23(1):32-34.[13]李振华。杜仲的现代药理学研究及临床应用文献综述[J].甘肃科技纵横，2018,47(3):93-96.[14]何正有，王光萍，陈士林，等。杜仲研究进展[J].中国中药杂志，2002,27(12):881-885.[15]王喆之，陈新，张康健，等。杜仲的化学成分、药理作用研究进展[J].西北植物学报，2002,22(5):1306-1311.[16]黄璐琦，袁媛，郭兰萍，等。中药材DNA条形码分子鉴定研究[J].中国中药杂志，2010,35(2)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