CN119487183A 用于生产重组细小病毒的组合物和方法 （艾诺健基因治疗股份有限公司）

2024.12.09PCT/US2023/0641522023.03.10WO2023/220502EN2023.11.16公开了用于生产重组细小病毒的表达构建毒生产所必需的细小病毒蛋白；以及(3)重组细21.一种用于重组细小病毒生产的多核苷酸表达构建体，所述多核苷酸表达构建体包(4)细小病毒蛋白编码区，所述细小病毒蛋白编码区编码所述重组细小病毒生产所必(6)一个或多个调控元件，所述一个或多个调控元件允许在宿主细胞中表达所述E4开3.根据权利要求2所述的表达构建体，其中，所述经且其中，所述细小病毒蛋白编码区包含编码AAVRep蛋白的AAVRep编码区和编码AAVCap3将根据权利要求1至9中任一项所述的表达构建体引入到宿对携带所述表达构建体的所述宿主细胞进行温育，持续期望的时间段，11.一种用于生产重组细小病毒的多核苷酸表达构建体，所述多核苷酸表达构建体包编码区包含E4orf6/7内含子1或E4orf6/712.根据权利要求11所述的表达构建体，其中，所述经修饰的腺病毒E4编码区包含与Ad2基因组的核苷酸序列32645_35835相对应的序列，所述序列具有E4orf6/7内含子2的部E2a或晚期E2a内含子1的部分或完全缺失；(ii)E2a内含子2的部分或完全缺失；或(i)和编码区包含密码子优化的SEQIDNO:18.根据权利要求11所述的表达构建体，其包含：(1)422.根据权利要求20或21所述的表达构建体，其中，所述AA表达盒，所述表达盒包含编码目的基因的序列和与编码目的将根据权利要求11至19中任一项所述的表达构建体、编码AAVRe的AAV反式质粒以及编码重组AAV基因组对携带所述表达构建体、所述AAV反式质粒和所述AAV顺式质粒的所将根据权利要求20至23中任一项所述的表达构建体和编码重组AAV基因组的AAV顺式对携带所述表达构建体和所述AAV顺式质粒的所述宿主细胞进行温育，持续期望的时将根据权利要求24所述的表达构建体以及编码AAVRep蛋白和AAVCap蛋白的AAV反式对携带所述表达构建体和所述AAV反式质粒的所述宿主细胞进行温育，持续期望的时5[0001]本申请要求于2022年5月12日提交的美国[0003]通过用治疗性转基因表达盒替代所有病毒基因，同时保留载体包装和DNA复制所因的含ITR的质粒两者都能被引入到合适的细胞中进行生产。经转染的细胞然后可以感染腺病毒或单纯疱疹病毒等辅助病毒，所述辅助病毒反式激活存在于辅助质粒上的AAV启动宿主免疫系统对痕量水平的残留辅助病毒产生抗辅助病毒免疫应[0005]最近开发出一种三质粒转染方法。这种方法使用AAV血清型特异性Rep和Cap质粒6[0008]本申请的另一方面涉及一种用于生产重组腺相关病毒(AAV)的多核苷酸表达构建[0009]本申请的另一方面涉及一种用于使用本申请的表达构建体生产重组细小病毒颗[0010]图1示出了描绘腺病毒(Ad2)编码区相对于本申请的一系列示例性表达盒中各种[0012]图3示出了描绘Ad2E2a编码区、Ad2E2A启动子和在感染早期和晚期表达的[0013]图4示出了含有图1所示的Ad辅助基因的对应布置的质粒构建体，即mini_[0014]图5示出了含有图1所示的Ad辅助基因的对应布置的质粒构建体，即mini_[0015]图6示出了图1所示各种缺失及其组合对表达盒充分提供AAV包装辅助功能能力的[0018]图9示出了基于mini_pHelper的AAV生产系统在悬浮培养的HEK293T细胞中的包7位基因变异或天然存在的突变事件不会产生异源D当的调控序列的控制下，多核苷酸中的核酸序列在体外末端的翻译终止密码子来界定。编码序列可以包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、修饰的编码区。例如，经修饰的腺病毒E4编码区可以包括Ad2基因组的核苷酸序列32645_8Ad2/5的E4开放阅读框6/7(E4orf6/7)编码的蛋白及其功能Ad2基因组的核苷酸序列10426_11156编码序列转录的DNA调控序列。进一步地，这些术语应广义地理解为同样涵盖其它调控元9且可在美国国家生物技术信息中心(NCBI，网址：)或UniProt数据库序列。到宿主细胞的基因组DNA中。本领域的普通技术人员已知用于将一个或多个外源核酸分子[0048]如果第一核酸或蛋白质中的核苷酸或氨基酸残基与第二核酸或蛋白质中的残基毒来源的核酸，这些核酸含有促进外源性并对病毒基因组复制所需的非结构蛋白(如NS1)码重组AAV基因组的序列包含位于表达盒每一类AAV载体所处的宿主细胞已经感染了合适的辅助病毒(或正在表达合适的辅助功能)并且二链合成，而是两条互补的scAAV半分子将结合形成一条能够立即复制和转录的双链DNA以及包封的rAAV载体基因组，所述载体基因组包含一段在两侧连接有AAVITR的目的异源重组核苷酸序列)包装到感染性重组病毒粒子颗粒中以供后续因组每一端的区域，这些区域在顺式作用中作为DNA复制的起始点并且作为病毒基因组的之间的核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中。AAVITR区域的核苷酸序列是本领域中体切除和恢复目的序列，并且当AAVRep基因产物存在于细胞中时允许异源序列整合到接以及博卡病毒和原细小病毒等其它细小病毒中[0068]术语“Cap编码区”是指细小病毒基因组中本领域已知的编码病毒衣壳蛋白的区而所述AAV基因产物则以反式作用促进高效AAV复制。因此，AAV辅助功能包括Rep区和Cap提供AAV载体中已删除的AAV功能的核苷酸序列，所述AAV载体将用于生产递送目的核苷酸病毒VARNA基因区或腺病毒E2A基因区的功能同源物涵盖此类基因区的衍生物和类似物，同源物仍有能力提供其固有的附属功能，以超出背景水平且可检测的水平支持AAV病毒粒毒基因的序列；以及(2)编码细小病毒非结构蛋白和结构蛋白(比如AAVRep蛋白和Cap蛋毒基因的序列；(2)编码细小病毒非结构蛋白和结构蛋白(比如AAVRep蛋白和Cap蛋白)的示出了用于三质粒AAV生产系统的示例性构建体。表达构建体包含经修饰的腺病毒E4编码区或经修饰的腺病毒E2a编码区，并且能够表达一种或多种腺病毒E4蛋白或腺病毒E2a蛋[0087]在一些实施例中，表达构建体包含经修饰的腺病毒E4编码区和经修饰的腺病毒编码区以及编码一种或多种腺病毒相关RNA(VARNA)的序列，并且能够表达经编码的腺病[0091]经修饰的腺病毒E4编码区编码能够支持宿主细胞中细小病毒复制的功能性E4蛋不包含由E4orf1_4和E434K蛋白的全部或部分编码的多肽[0094]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E4编码区包含E4orf6/7内含子2的部分或完全[0095]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E4编码区包含E4orf6/7内含子1的部分或完全[0097]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E4编码区包含与Ad2基因组的核苷酸序列[0098]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E4编码区包含与Ad2基因组的核苷酸序列32645_35835相对应的序列，所述序列缺失E4orf6/7内含子2的整个序列(711bp，SEQID修饰的腺病毒E4orf6/7编码区包含编码腺病毒E4orf6/7蛋白(SEQIDNO:8)的密码子优化[0101]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E2a编码区包含晚期E2a内含子1和/或晚期E2a提供用于在非E2a表达宿主细胞中生产细小病毒所需的E2[0103]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E2a编码区包含与Ad2基因组的核苷酸序列E2a编码区包含与Ad2基因组的核苷酸序列22233_27575相对应的序列，所述序列具有蛋白编码序列)晚期E2a内含子1的部分或完全缺失；(b)晚期E2a内含子2的部分或完全缺[0108]用于本申请的组合物和方法的腺病毒及其核酸片段包括腺病毒科的所有人腺病与腺病毒E4启动子可操作地连接。在一些实施例中，经修饰的腺病毒E4编码区与包含SEQ[0115]在一些实施例中，本申请的表达构建体中的经修饰的腺病毒E2a编码区与调控元区与包含SEQIDNO:23的腺病毒E2a启动子可达的一个或多个密码子优化的蛋白。可以对编码本申请蛋白质的多核苷酸进行密码子优保氨基酸序列没有改变。密码子优化方法是本领域已知的，并且例如在美国申请公开第2008/0194511号和美国专利第6,114,1[0118]在一些实施例中，本申请的表达构建体包含(a)包含密码子修饰的E4编码序列的经修饰的腺病毒E4编码区，或(b)包含密码子修饰的E2a编码序列的经修饰的腺病毒E2a编[0119]在一些实施例中，本申请的表达构建体包含(a)包含密码子修饰的E4编码序列的经修饰的腺病毒E4编码区，以及(b)包含密码子修饰的E2a编码序列的经修饰的腺病毒E2a[0120]在一些实施例中，本申请的表达构建体包含包括密码子修饰的核苷酸序列(SEQ码子修饰的核苷酸序列(SEQIDNO:4)的经修饰的腺病毒霉素(neomycine)抗性基因和卡那霉素(kanamyci[0124]在一些实施例中，设计用于三质粒细小病毒生产系统的表达构建体的大小小于SEQIDNO:4)、编码腺病毒VAIRNA编码区的序列(包含SEQIDNO:16)以及调控区(包含小病毒生产系统的表达构建体中描述的元件中的一个或多个，还包含细小病毒蛋白编码放阅读框6/7的经修饰的腺病毒E4编码区；(2)编码E2a蛋白的经修饰的腺病毒E2a编码区；(3)编码腺病毒VARNA的序列；(4)编码重组细小病毒基因组的序列(例如在一侧连接有至放阅读框6/7的经修饰的腺病毒E4编码区；(2)编码E2a蛋白的经修饰的腺病毒E2a编码区；(3)编码腺病毒VARNA的序列；(4)编码重组AAV基因组的序列(例如侧接有两个ITR的转基[0137]在一些实施例中，用于双质粒细小病毒生产系统的表达构建体是用于AAV生产的[0138]在一些实施例中，用于双质粒细小病毒生产系统的表达构建体是用于AAV生产的组包含转基因表达盒(包含与一个或多个调控元件可操作地连接的目的转基因)以及两个功能，并且需要用于在提供腺病毒E1a和E1b蛋白的内源性表达的宿主细胞中生产细小病毒E1a和E1b蛋白的内源性表达的宿主细胞中生至少一个ITR，所述表达盒具有编码转基因的核苷酸序列以及与所述核苷酸序列可操作连入GOI的克隆位点和在所述克隆位点附近并且当所述GOI插入在所述克隆位点处时能够与[0148]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E4编码区包含与Ad2基因组的核苷酸序列[0149]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E4编码区包含与Ad2基因组的核苷酸序列[0153]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E2a编码区含有密码子修饰的或未经修饰的序[0154]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E2a编码区含有密码子修饰的或未经修饰的序[0155]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E2a编码区含有密码子修饰的或未经修饰的序[0156]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E2a编码区含有密码子修饰的或未经修饰的序[0157]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E2a编码区含有密码子修饰的或未经修饰的序[0158]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E2a编码区包含晚期E2a内含子1和/或晚期E2a提供用于在非E2a表达宿主细胞中生产细小病毒所需的E2[0160]在一些实施例中，经修饰的腺病毒E2a编码区包含与Ad2基因组的核苷酸序列含与Ad2基因组的核苷酸序列22233_27575相对应的序列，所述序列具有1897bp缺失(SEQ经修饰的腺病毒E2a编码区包含晚期E2a内含子1和/或晚期E2a内含子2的部分缺失，其中，蛋白编码序列)晚期E2a内含子1的部分或完全缺失；(b)晚期E2a内含子2的部分或完全缺中，腺病毒E4启动子包含SEQIDNO:22。在[0168]在一些实施例中，设计用于单质粒细小病毒生产系统的表达构建体的大小小于[0169]在一些实施例中，设计用于单质粒细小病毒生产系统的表达构建体的大小在7_[0177]本申请的另一方面涉及使用本申请的表达构建体生产重组细小病毒颗粒的方病毒蛋白的细小病毒反式构建体；以及(C)含有编码重组细小病毒基因组的序列的细小病(3)在温育时间段之后采集所述重组细小病毒颗粒。在一些实施例中，重组细小病毒是实施例中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，如人HuH7和HEK293细胞、中国仓鼠卵巢细胞[0184]在一些实施例中，本申请的表达构建体和其它表达构建体(如果存在的话)通过CaPO4介导的转染、脂质或聚合物分子(如聚乙烯亚胺(PEI))转染到HEK293细胞(可从[0185]无需进一步详细阐述，相信本领域技术人员可以基于以上描述充分利用本公[0187]本申请的另一方面涉及一种用于生产重组细小病毒的试试剂盒包含本申请的表达构建体和关于所述表达构建体使用方GOI的克隆位点和在所述克隆位点附近并且当所述GOI插入在所述克隆位点处时能够与所位于所述表达盒一端的至少一个ITR，所述表达盒具有编码转基因的核苷酸序列和与所述毒(Ad2)编码区和周围缺失相对于Ad2核苷酸序列坐标的一系[0194]图2示出了图1中描绘的AdE4orf和周围缺失相对于Ad2基因组序列的布置的扩展[0196]图4示出了含有本申请的表达盒的实施例的示例性辅助质粒，即mini_pHelper质示的野生型AdE2a氨基酸序列。[0197]图5示出了含有本申请的表达盒的另一实施例的另一示例性辅助质粒，mini_[0199]图6示出了图1中缺失或缺失组合对表达盒充分提供腺相关病毒(AAV)包装所需辅图1所示Ad辅助基因布置的Ad辅助质粒(如pHelper、pHelper_dE4Orf6/7内含子、mini_[0201]图7示出了原始三质粒转染系统与基于mini_pHelper的生产系统之间比较的示意[0202]mini_pHelper_AAV2(SEQIDNO:10)的构建：使用ClaI酶切Mini_pHelper1.0质质粒并且用作主链。使用SbfI从pAAV_CMV_EGFP中酶切分离插入物，即ITR_CMV_EGFP_ITR[0205]图8示出了基于mini_pHelper的AAV生产系统在贴壁HEK293T细胞中的包装效[0206]图9示出了基于mini_pHelper的AAV生产系统在悬浮培养的HEK293T细胞中的包总DNA为0.75μg/106个细胞。在单质粒系统中，用固定的PEI:DNA比率2:1转染不同量的质[0207]图10示出了基于mini_pHelper的双质粒V2系统对不同AAV血清型的包装效率。在pHelper_1.0和mini_pHelper_Rep(SEQIDNO:13)用作105拷贝数/细胞。PEI用作1.5μg/[0210]图12示出了含有本申请表达盒的另一实施例的示例性辅助质粒pAAVone_AAV2_Cap基因以及重组AAV基因组的序列(ITR_[0213]2023年3月10日提交的名为2037_004US.xml的序列表xml权利要求旨在以有效达到预期目标的任何顺序覆盖所要求保护的组件和