CN119487394A 炎症性疾病用斑马鱼动物模型和使用其筛选抗炎剂的方法 （瑞德尔韩国有限公司）

2024.12.30PCT/KR2023/0064612023.05.12WO2024/005358KO2024.01.04炎症性疾病用斑马鱼动物模型和使用其筛本发明涉及一种使用糖毒性CML产生斑马鱼新型抗炎剂可以以更方便和更经济的方式预防23)通过将上述斑马鱼与仅用CML处理的斑马鱼进行比较来确认测试物质的效果的步3.根据权利要求2所述的用于筛选抗炎剂的方4.根据权利要求1所述的用于筛选抗炎剂的方法，其中步骤1)的斑马鱼胚胎是受精后5.根据权利要求1所述的用于筛选抗炎剂的方法，6.根据权利要求1所述的用于筛选抗炎剂的方法，其中通过上述步骤1)发炎的斑马鱼7.根据权利要求1所述的用于筛选抗炎剂的方法，其中所述步骤3)是比较未用所述测试物质处理的对照组和用所述测试物质处理的组的斑马鱼胚胎的存活试物质处理的组的斑马鱼胚胎的存活率相比于未处理的对照组的斑马鱼胚胎的存活率增9.根据权利要求1所述的用于筛选抗炎剂的方法，其中在上述步骤3)中确认斑马鱼的10.根据权利要求9所述的用于筛选抗炎剂的方法，其中如果在CML注射后所述斑马鱼试物质处理的对照组和用所述测试物质处理的组的斑马鱼成体的存活16.根据权利要求15所述的用于筛选抗炎剂的方法，其中如果用所述测试物质处理的319.根据权利要求18所述的用于筛选抗炎剂的方法，其中当与未用所述测试物质处理20.根据权利要求18所述的用于筛选抗炎剂的方法，其中当与未用所述测试物质处理4[0001]本发明涉及一种使用糖毒性CML产生斑马鱼胚胎和成体炎症模型的方法，其对于开发预防或治疗炎症性疾病的药物和使用其筛选抗炎剂细胞因子，使大量促炎细胞因子的水平迅速增加。这种现象被称为细胞因子风暴综合征5经尝试用于治疗细胞因子风暴综合症的药物包括过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂鞘血症等)的恶化密切相关。糖基化是一种其中碳水化合物与蛋白质连接的非特异性的非酶病毒活性并可以杀死COVID_19病毒，但异常的HDL丧失其抗病毒活性并显示出使巨噬细胞H.J.Nativehigh_densitylipoproteins(HDL)withhigherparaoxonaseexertsapotentantiviraleffectagainstSARS_CoV_2(COVID_19),whileglycatedHDLlosttheantiviralactivity.Antioxidandensitylipoproteinbyadvancedglycationendproductscontributestothedyslipidemiaofdiabetesandrenalinsufficiency.ProcNatlAcadSciUSA终使炎症标志物高灵敏度C_反应蛋白(hs_CRP)升高(TheJournalofClinical6[0016]尽管哺乳动物作为用于新药发现和疾病研究的动物模型具有与人类遗传和生理从1980年代早期建立动物模型以来，斑马鱼(zebrafish/Daniorerio)已被开发为用于药发明首次公开了一种使用CML羧甲基赖氨酸(CML)的炎症性疾病用斑马鱼动物亡和发育障碍以及成体的神经麻痹，并且通过与CML一起同时注射抑制这些作用的测试物7[0026]3)通过将上述斑马鱼与仅用CML处理的斑马鱼进行比较来确认测试物质的效果的过使用斑马鱼成体和胚胎以及晚期糖基化终产物CML来诱导胚胎死亡、急性细胞因子风暴微注射至斑马鱼胚胎后24和26小时的斑马鱼胚胎的发育阶[0034]图6是显示通过将CML腹膜内注射至斑马鱼成体中而急性麻痹的斑马鱼的游泳能[0036]图8是比较当仅用PBS和仅用CML处理时斑马鱼成体的肝组织中炎性细胞浸润的程理斑马鱼成体并确认斑马鱼的游泳能力来比较通过测试物质抑制细胞因子风暴的测试物[0038]图10是通过分别用CML和Remsima(英夫利昔单抗)以及CML和Actemra(托珠单抗)同时处理斑马鱼成体并确认斑马鱼的游泳能力来比较由测试物质恢复的斑马鱼的游泳能[0039]图11是通过分别用CML和Remsima(英夫利昔单抗)以及CML和Actemra(托珠单抗)同时处理斑马鱼成体并确认斑马鱼的游泳能力来比较由测试物质恢复的斑马鱼的生存力[0040]图12是一组显示了肝组织的照片，其中比较了当Remsima(英夫利昔单抗)和8[0044]图16是比较仅注射CML或将CML和测试物质一起注射后的血清淀粉样蛋白A(SAA)[0045]图17是比较仅注射CML或将CML和测试物质一起注射后的白细胞介素_6(IL_6)水[0052]3)通过将上述斑马鱼与仅用CML处理的斑马鱼进行比较来确认测试物质的效果的的氨基酸基团(如赖氨酸残基)和还原糖之间发生。蛋白质的非酶促糖基化是这样一种反类型的特异性受体识别，并引起糖尿病并发症(比如9[0060]所述CML是由Amadori产物氧化降解产生的主要晚期糖基化终产物，CML是热化学经典的Hodge途径，在该途径中葡萄糖与蛋白质中的[0062]在本发明的一个具体实施方案中，斑马鱼胚胎可以是受精后15至45分钟(1/4h至[0066]通过上述步骤1)诱导的具有炎症的斑马鱼胚胎的存活率可以为14％至32优选[0073]中脑后脑边界(MHB)在脊椎动物的胚脑中高度保存并折叠。斑马鱼中的中脑后[0080]当用测试物质处理的斑马鱼成体的存活率相比于未用测试物质处理的对照组增[0083]当用测试物质处理的组的总胆固醇和甘油三酯的水平低于未用测试物质处理的[0087]实施例1：斑马鱼胚胎中急性细胞因子风暴诱导系统的构建及细胞因子风暴抑制[0089]本发明人构建了显微注射了CML的斑马鱼胚胎动物模型，以建立急性细胞因子风暴诱导系统。在显微镜下确认刚产卵的斑马鱼胚胎为受精后30分钟(受精后0.5小时槽的1％琼脂糖凝胶上。将微型玻璃针连接到显微注射器(PV一830,WorldPrecision处于2细胞和4细胞阶段的斑马鱼胚胎中。卵水(0.02mg/L亚甲基蓝)，并在28℃下储存。所有注射过程都在立体显微镜(SMZ一168,Motic,HongKong)下以20倍放(PBS对照)和CML注射组。CML注射组向斑马鱼胚胎中显微注射了20nLCML溶液(25mg/mL中个体在CML注射后24小时表现出畸形发育，在CML注射后25小时保持在21一体节阶段(图头头部)存在发育畸形，眼睛色素沉着非常不清晰，尾部没有伸长，并且没有观察到脑的MHB。[0099]<1_4>通过CML与Remsima(英夫利昔单抗)和Actemra(托珠单抗)的组合显微注射[0100]本发明人使用了Remsima(英夫利昔单抗)和Actemra(托珠单抗)两种生物药物来选择用于抑制由CML引起的急性细胞因子风暴和使神经麻痹恢复的新[0101]向斑马鱼胚胎显微注射了20nLCML溶液(25mg/mLPBS溶液)，即最同时注射了CML和Actemra(托珠单抗)的胚胎的存活率为53.1％。与显示67.2％存活率的PBS注射对照组相比，证实了共注射了CML和Actemra(托珠单抗)的胚胎的存活率高于共注CML和Remsima(英夫利昔单抗)的胚胎和共注射了CML和Actemra(托珠单抗)的胚胎显示与[0105]在PBS对照组中，观察到在受精后约25小时的发育阶段(原基_6)出现的特征。在[0106]当同时将CML和Remsima(英夫利昔单抗)或CML和Actemra(托珠单抗)显微注射到[0107]实施例2：斑马鱼成体中急性细胞因子风暴诱导系统的构建及麻痹诱导后细胞因[0109]本发明人构建了注射CML的成体斑马鱼动物模型，以建立急性细胞因子风暴诱导[0113]为了比较CML诱导急性细胞因子风暴和减轻的程度，对PBS注射组和CML注射组的是在仅注射CML60分钟后的存活率低于49这证明了由急性细胞因子风暴导致的死亡程[0118]本发明人使用了Remsima(英夫利昔单抗)和Actemra(托珠单抗)两种生物药作为测试物质来比较抑制由CML引起的急性细胞因子风暴和治疗神经毒性的效果，所述两种生Actemra(妥珠单抗)的组的斑马鱼的游泳能力来比较测试物质的细胞因子风暴抑制能力[0120]比较了CML和Remsima(英夫利昔单抗)注射组以及CML和Actemra(妥珠单抗)注射组中的测试物质的效果。结果，与注射43μgRemsima(英夫利昔单抗)相比，当注射44μg[0121]用Actema(托珠单抗)(一种白细胞介素_6(IL_6)抑制剂)组合处理组的斑马鱼显因子_α(TNF_α)抑制剂)组合处理组的斑马鱼显示存活率为63这与PBS处理组的存活率了Actemra(托珠单抗)的组合处理在减轻急性麻痹和神经毒性以及恢复游泳能力方面比[0123]当使用苏木精_伊红(H&E)染色比较炎性细胞的浸润时，仅用CML处理的组和同时似。即，IL_6抑制剂Actemra(托珠单抗)对CML诱导的糖毒性所致的炎症的抑制作用大于[0125]用浓度为3mM的CML处理斑马鱼成体，同时进行了Actemra(托珠单抗)和Remsima中炎性细胞的增加使血液中总胆固醇和甘油三酯增加(Feingold,K.R.,&Grunfeld,C.胞因子风暴的改善最显著，这与肝组织中炎性细胞浸润的减少非常一致。然而，同时用Remsima(英夫利昔单抗)处理的组显示与仅用CML处理的组相似的总胆固醇和甘油三酯浓[0128]<2_6>测试物质对由CML导致的血清淀粉样蛋白A、白细胞介素_6和肿瘤坏死因子白细胞介素_6(IL_6)(一种诱导肝脏中的急性细胞因子风暴的因子)和肿瘤坏死因子_α51.8±1.8pg/mL(图17)。TNF_α在仅用CML处理的组中最高，为43.5±0.4ng/mL，在用胞因子风暴的改善最显著，这与肝组织中炎性细胞浸润的减少非常一致。然而