DNA细胞周期检测

DNAAnalysisByFlowCytometry核医学生物技术重点实验室KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity基本原理概述•正常人静止体细胞有46条染色体

，

相当于7.10-12pgDNA/细胞核

，

我们称之为二倍体

细胞

，

而正常增殖细胞则存在不同的DNA含

量

。在细胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各

个时期

，DNA的含量随各时相呈现出周期性

的变化：

在G1期

，

细胞开始RNA和蛋白质的

合成

，

但DNA含量仍保持二倍体;KeylabofMedical

CollegeofSuZhou

University•进入S期后

，DNA开始合成

，

这时细胞核内DNA的含量介于G1和G2期之间;当DNA复制结束成为4倍体时

，

细胞进入G2期

，G2期细胞

继续合成RNA及蛋白质

，

直到进入M期

，

因此

，

单纯从DNA含量无法区分G2期和M期;一旦有丝分裂发生

，

细胞分裂成两个子细胞

，

这两

个子细胞或者进入下一个细胞周期

，

或者进入

静止期(G0期)，

而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分

。

因此

，

整个复制周期可以描

述为G0/G1，S，G2/M期。

KeylabofMedical

CollegeofSuZhou

University•通过核酸染料标记DNA，

并由流式细胞仪

进行分析

，

可以得到细胞各个时期的分布

状态

，

计算出G0/G1%，S%及G2/M/%，

了解细胞的增殖能力

，

在肿瘤病理学研究中

，

通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态

的指标

。正常细胞具有较恒定的DNA含量

，

而细胞癌变过程中结构和/或染色体的异常

是很常见的

。这种变化在流式分析中以DNA倍体指数的形式表现出来

，

这一指数对于肿瘤的早期诊断

，

交界瘤、

间叶组织

肿瘤的良恶性判断提供了重要的辅助指标。KeylabofMedical SuZhouUniversityCollegeofS合成期

G2/M合成后期及分

裂期流式DNA周期示意图G0/G1静止期及合成前期KeylabofMedical

CollegeofSuZhou

University样本制备•来源于血液、骨髓、体液、灌洗液、外科手

术活检、细针穿刺物等的细胞都可用来做DNA分析

。新鲜的、冰冻或固定保存的、或常规固定/包埋用于组织检查的样本均可

。通

常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本

。用组

织切片的好处是可以通过观察常规染色来选

择感兴趣的区域,缺点是不能再用抗体染色

来鉴别肿瘤细胞和正常基质细胞。

KeylabofMedical

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University实体标本的单细胞制备•机械法:用剪刀、刀片剪切组织或金属网研

磨获取完整的细胞

。但该法获取的细胞数量

少。•化学药品处理法:利用EDTA或Sodiumcitrate结合Ca2+或Mg2+等阳离子

，

破坏细胞间的连接或用TritonX-100、NP-40破坏细胞膜

。该

法只能取得细胞核

，

且易出现核凝集。•酶法:利用酶将细胞间的连接物水解

，

使细

胞从组织中分离出

。一般常用的为胃蛋白酶及胰蛋白酶

。该法也只能取得细胞核。CollegeofSuZhouUniversityKeylabofMedical细胞浓度及质量要求•单细胞和核的最终浓度应约106/ml。浓度太

低

，

上机时样本的流速不得不提高

，

这样就

会影响检测的CV。浓度太高

，

则可能导致染

料的相对不足

，

最终使染色不饱和

，

同样影

响CV和检测结果。•制备完成后的标本应用光学显微镜检查其质

量：

细胞是否聚集或过多的碎片；

大多数核

有肿瘤样的外观(比如说

，

不是粒细胞)等

。

保证足够的肿瘤细胞含量；

检测S%时建议的

最小可接受比例是20%。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity固定•常用70%的冰酒精固定单细胞悬液

。应保证样本完全浸没在固定剂中置40C冰箱固定4小

时上。•对于甲醛固定的组织切片

，

应注意甲醛会影

响PI与核酸的结合

。若同时使用抗体鉴别肿

瘤细胞

，

应选择对抗原无损的固定剂

。对许

多细胞

表面抗原来说

，

固定只能在抗体标记之后进行。

KeylabofMedical

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University染色•染料的选择取决于流式激光的配置

。488nm的激光下应用PI(碘化丙啶),由于PI也与双链RNA结合,所以分析前样本应用Rnase处理。重要的是染料要足够,以保证饱和结合

。PI的推荐浓度是至少20ug/106个细胞

。其最佳

浓度为50ug/106个细胞

。在室温<200C下避光

孵育30分钟,3小时内上机分析。

KeylabofMedical

CollegeofSuZhou

University影响荧光染色的因素•温度:温度

于200C时

，

即出现温度淬灭。•PH:PI在7.27.6，

保持荧光染料分子与溶剂

间的电离平衡。•荧光染料浓度:染料太少

，

结合不完全

。染

料过多

，

又会出现浓度淬灭现象。•固定剂:醛类固定剂会干扰插入性染料与核

酸分子的结合

，

造成荧光发射强度减弱。•杂质:溴化物、碘化物、硝基苯、铁、银等，

对荧光有淬灭作用。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversityDNA的参考标准•样本的倍体是根据二倍体细胞峰的标准来计

算的

。

临床标本中常常有一些正常的二倍体

核存在,可用来作为标准

。但问题是如何判

断哪个峰是正常二倍体细胞

。事先加入标准

参照细胞(如鳖或鸡红细胞)会有助于判断

。

特殊细胞类型的特异性抗体标记也有助于检

出肿瘤群体

。标准参照细胞应尽可能早加入

标本,与样本一起制备。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversityDNA检测•(1)DNA检测采用线性放大

。应检查放大器的线

性度(如用标准荧光微球、多倍体的肝细胞、有

聚集体的固定的淋巴细胞、鸡和鲑鱼红细胞等)。•(2)应每日通过检测标准微球或固定、染色的淋

巴细胞的CV来检查仪器调校情况

，

此CV应<=2%。•(3)DNA直方图的道数值应至少为512。应以正

常二倍体细胞的G1峰位置来调节PMT电压值：G1峰道数应不低于最大道数的五分之一

，

即1024道时的200，512道时的100。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity•(4)阈值应设在DNA荧光参数上FL3Peak30-40。•(5)所有的信号都应被收集,包括从二倍体G1峰道数值1/10处以上的碎片。•(6)收集的细胞总数应在DNA直方图中足够提

供10000个核(除外碎片)。DNA直方图越复杂,需要收集的细胞数量越多

。若需报告S期数值,则S期区域至少应有100个细胞。•(7)为获得最佳CV,流速应保持在低速(通常100-300个粒子/秒)。llUniversitySu

ZhMedicofofegeablyCK多参数分析•尽可能地显示FSCvsSSC的双参数图

。碎片

常常能被区分开来

，

用设门去除

。制备较好

的标本中

，

炎性细胞常可以和肿瘤细胞区分。•荧光素标记的抗体常被用来区分正常和肿瘤细胞

。如上皮性肿瘤中可用抗cytoketatin的染色来鉴定上皮细胞;在非淋巴细胞肿瘤中

，

正常的炎性细胞可用白细胞共同抗原CD45来

区别;淋巴性肿瘤中则可根据肿瘤的分类选

择合适的细胞表面抗原。•利用Ki67、PCNA来鉴别G0与G1期、G2与MKeylabeicalCollegeofSuZhouUniversity常用术语•CoefficientofVariation(CV):变异系数

。不

同细胞群体DNA含量的细微差别可能有生物学上的重要意义•DNAindex(DI):DNA指数

。DI指的是肿瘤样

本G0/G1峰的平均荧光道数与正常人二倍体G0/G1峰的平均荧光道数之间的比值。•Ploidy:倍体

。原指染色体数目

。流式中用来

描述总的DNA含量

。二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。KeylabofMedicalCollegeofSuZhouUniversity判断标准组织标本：•DI=0.9~1.1二倍体•其余为异倍体

。（DI：0.85~0.9或1.1~1.15为

近二倍体；DI>1.15为超二倍体；DI<0.85为亚二倍体

。)•但对于四倍体和G2/M期的判断

，

一般用G2/M占G0/G1的20%以上即算四倍体。

KeylabofMedical

CollegeofSuZhou

University浆膜腔脱落细胞良恶性判断标准1.出现DNA的非整倍体峰为恶性肿瘤细胞。2.无明显的非整倍体峰

，

但有一突出的四倍体峰和大于15%的S期细胞

，

并伴有 G0/G1期CV值大于9%为恶性肿瘤细胞

。3.无明显的非整倍体峰

，

但G0/G1期CV值增大

，

并伴有大于10%~15%的S期和