从多重染色到可信数据：mIHC-IF图像分析与数据共享的标准化（SITC共识二）

从多重染色到可信数据：mIHC/IF图像分析与数据共享的标准化（SITC共识二）多重免疫组化与免疫荧光（mIHC/IF）实验需要投入大量的工作进行优化和验证，为此肿瘤免疫治疗学会（SITC）组建了专题工作组，对其制定相关的实践指南。2020年发布关于染色种类和验证的共识（点击查看），2025年发布结果图像分析和数据管理的考量要点，同年还进一步发布STORMI报告规范，将分析验证、图像采集、图像配准、细胞聚类、空间分析等内容转化为可执行的报告清单。本文将重点关注图像分析与数据管理相关标准化操作，会涉及到图像采集、颜色反卷积、光谱拆分、组织及细胞分割、细胞表型判定、算法验证等实操方案，以及探讨批间校正、拼接图像质量控制以及原始数据输出、核心分析程序与源代码、代表性显微图像的共享建议。一、图像采集：从主观选择到规范成像筛选基于组织的预测性生物标志物，可用来评估免疫疗法或在研新药的治疗效果。多重免疫组化与免疫荧光（mIHC/IF）定量分析不同免疫细胞亚群的数量、表型，以及标志物在肿瘤、间质等区域的分布特征和共表达模式，让肿瘤微环境解析进入单细胞空间维度。在一项荟萃分析中，评估了mIHC/IF、PD-L1IHC、IFN-γ基因特征、突变负荷（TMB）在抗PD-L1疗法效果方面的预测效能，结果显示mIHC/IF的汇总受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.8，而其他技术约为0.65-0.7，说明mIHC/IF具备成为伴随诊断的潜力。成功的多重染色能够产出可信的染色图像，但从切片上的显示信号到可重复、可横向对比的定量结果，需要一整套完整的图像采集、处理、分析流程，必要时还要借助专用的计算机算法。分析环节规范不统一，难以实现不同实验室结论的互证。图像采集是整个分析流程的起点，要在配套的应用软件中设置采集方案，确定显微镜物镜参数及每组滤光片对应的曝光时长。是扫描整张切片还是选取几个高倍视野（HPF）或特定感兴趣区域（ROI）？需要根据具体的研究问题、分析方法和所使用的技术平台决定。比如单张切片多重免疫组化连续染色（MICSSS）一般采集全切片图像，mIF可采集ROI或整张切片。科研人员必须完整描述ROI选取方案，包括每份样本分析的ROI数量、选取依据及标准。ROI选取方式差异大，受操作人员主观影响大，同时也受组织样本大小影响，比如粗针穿刺活体样本与手术切除大体积样本。一般需要采集5个高倍视野，每个视野面积约0.33-0.64mm2。有研究依据形态学特征或免疫细胞密度有针对性的选取，还有一些会同时对肿瘤核心区及肿瘤浸润边缘的免疫细胞进行评估。如果目标标志物或细胞表型罕见，或异质性强，则需要扩大选取范围。全切片成像在时间和算力上要求高，但随着技术的进步，分析整张切片逐渐成为常规。先进行全切片成像，再自动识别ROI，有助于提高mIF检测的信噪比和预测效能。mIF全切片扫描及ROI采样策略。A：10倍全景扫描；B：热点取样策略，免疫细胞富集区域；C：代表性采样，覆盖肿瘤结节中心、外周区域以及免疫细胞浸润丰富和缺失区域；D：高倍视野，C中一个ROI的放大图。二、颜色反卷积与光谱拆分获取图像后，我们首先要对信号进行拆分，便于精准判定标志物表达水平。该预处理过程会对后续的细胞分割、细胞表型判定及评分分析产生显著影响。mIHC和mIF分别采用颜色反卷积和光谱拆分。颜色反卷积是将RGB彩色图像中混合的多种染色信号拆解为独立的单通道灰度图像，各显色剂被分配专属色码，生成组织伪彩图片。该方法基于Ruifrok&Johnston算法，假设染色剂浓度与吸光度之间呈线性关系，可通过QuPath、ImageJ/Fiji等软件的ColorDeconvolution进行拆分。光谱拆分是将多种荧光基团的特征信号拆分为独立单通道信号，一般通过成像工具中的LinearUnmixing或SpectralUnmixing功能完成。该过程通常需要构建光谱库，即通过单染组织样本获得的每一种荧光基团的发射光谱。光谱库作为拆分算法的输入数据，判断复合叠加信号中各个荧光基团的信号贡献，常用非负矩阵分解算法。有些技术不需要光谱库可直接对RGB图像、mIF及流式信号进行拆分。mIHC/IF图像颜色反卷积和光谱拆分结果。A：上方是原始图，下方是类荧光伪彩图；B：合成图及单通道图像。三、组织与细胞分割拆分后的色彩和光谱信号将作为图像分析软件的输入数据，识别组织区域、组织分区及细胞或细胞组分等。组织分区与单个细胞边界的识别分别称为组织分割和细胞分割，通过图像分割（如强度阈值、边缘检测）、形态学相关图像处理实现，比如通过广谱细胞角蛋白的染色结果勾勒出上皮组织，将其与间质区分开。组织分割还有利于剔除伪影，比如组织褶皱、组织撕裂、切片粉尘以及手术切缘染色、遮盖组织的色素等。精准的细胞分割是完成单细胞或特定亚细胞结构中目标标志物定量的关键。细胞分割可实现对单个细胞笛卡尔坐标位置的精细评估，计算样本或ROI内的细胞密度、细胞间相互作用，分析蛋白质与mRNA的亚细胞定位差异。单标志物或多标志物共定位用于细胞表型判定及特定细胞群内功能标志物的表达水平（如Ki-67、颗粒酶B）。细胞分割高度依赖单个细胞核的识别。细胞核染色常用DAPI复染。基础算法在识别细胞核后会按照设定直径向外扩展细胞核边界，拟合细胞轮廓。细胞分割可同步对图像中的所有细胞类型进行分割，或单次仅分割单一形态的细胞。研究发现，在对所有细胞类型同步处理时，体积较大、形态不规则或呈树突状的细胞会出现过分割。分别执行分割会提高准确度，但会增加成本。对于淋巴细胞密度较高的组织，细胞排列紧密，分割容易产生误差。鉴于单细胞分割存在的诸多难点，研究人员提出了基于像素的分析方法，依据显色或荧光染色的信号有无与强度提取信息，随后对不同标志物开展聚类、共定位分析，或评估标志物间的空间关联及分布模式。该方法适用于细胞形态特殊、分割难度高的场景，或细胞撕裂、褶皱、坏死等缺乏细胞细节的组织区域，像素块还常用作AI算法的输入数据，深度学习方案有助于减轻高精度细胞分割算法的人工工作量。组织分割、细胞分割与基于像素的分析四、表型分析方法表型鉴定是依据色彩、光谱信号强度、细胞形态或上述特征的组合对细胞类型进行分类，该步骤通常在细胞分割完成后开展。判定细胞某一特征是否为“阳性”，可采用阈值法或机器学习分类器实现。建议在文章的方法部分详细说明所使用的表型鉴定方案。1、常规阈值法阈值法是基于单一特征对细胞进行分类的方法。经分割后的细胞拥有多种特征，例如各亚细胞区域（细胞膜、细胞质、细胞核及整个细胞区域）对应的色彩或光谱表达强度。将这些特征数据设为临界值，筛选出“阳性”细胞群。阈值法应用广泛、操作直观、易于实现，但会随样本和操作人员的不同产生误差。2、机器学习法机器学习方法主要分为两大类：有监督学习与无监督学习，均可辅助进行表型鉴定。有监督算法依靠标注数据完成训练。操作人员结合细胞形态与标志物表达的目视判读结果，在图像上进行人工标注。依此作为样本库，通过算法对新细胞或新病例生成分类标签。常用的数学模型有RandomForest、BoostedDecisionTrees、Multidi-mensionalRegression、K-近邻算法、支持向量机（SVM）等。无监督学习则不需要标注数据，通过算法自主挖掘病理数据的内部模式、结构或关联关系，常用的算法包括k均值聚类、隐马尔可夫模型（HMM）、深度学习法等。阈值法与机器学习法可联合使用。如阈值判定确定PD-L1表达信号的临界值，机器学习识别细胞核大小、形态、信号强度等特征，率先PD-L1阳性的肿瘤细胞。深度学习可以提供更多解决方案，实现分割与表型鉴定同步完成。表型鉴定算法开发的迭代流程示意图在图像分析流程中，可采用不同的方式对算法性能进行评估，比如技术人员在选定视野内人工统计目标细胞数量，并与算法输出结果比对，通过斜率、相关系数评估结果一致性。结合灵敏度和特异性，对算法进行优化。理论上，训练一套图像分析算法，可以用于同一个研究项目甚至多个项目中的所有切片。但是当切片存在多个变量，或分批次染色时切片间信号强度存在差异，将会影响分析准确性。关于图像配准、质量控制、数据模型及代码共享原则将在下一篇文章中继续讨论，欢迎关注。[参考文献]TaubeJM,etal.SocietyforImmunotherapyofCancer:updatesandbest