CN119491034A 小rna文库制备过程中去除接头自连产物的方法 （中国科学院分子细胞科学卓越创新中心）

小RNA文库制备过程中去除接头自连产物的本发明提供了一种小RNA文库制备过程中去骤c)Cas_sgRNA复合物处理。本发明还提供了小RNA文库制备过程中去除接头自连产物和污染核2较佳地，所述步骤a2)是在变性慢退火条件下进行的，所述变性慢退火条佳地，对应10pg～100ngRNA，使用10～100个单位5’deadenylase酶和2～20个单位的3步骤c3)：使步骤c2)获得的PCR扩增产物与Cas酶和sgRNA混如权利要求1～5任一项所述的小RNA文库制备过程中去除接头自连产物的方法或如权反转录引物封闭模块，所述反转录引物封闭模块包含反转录引物且用于封闭3’端接第一次扩增模块，所述第一次扩增模块包含DNA扩增所需的酶且用于以所述反转录模Cas酶切模块，所述Cas酶切模块包含Cas酶和sgR第二次扩增模块，所述第二次扩增模块包含DNA扩增所需的酶且用于对酶切产物进行4佳地，对应10pg～100ngRNA，使用10～100个单位5’deadenylase酶和2～20个单位的5随机表达和生物大分子随机的相互作用等因素导致的细胞间内在的变异(Chappell备受瞩目。随着十年的发展与成熟，当前单细胞RNA测序技术已被广泛的应用于肿瘤发生[0003]相比于单细胞RNA测序方法的日新月异，单细胞小RNA测序方法的发展则相对迟缓。这主要是因为小RNA序列的特殊性导致了它无法像mRNA一样通过简单的反转录和扩增微长一些的piRNA最多也只有30多nt。这么短的序列使用随机引物进行反转录也是不太合的反转录和扩增(Hafneret.al..,2011)。其大致流程为小RNA首先在RNA连接酶的作用下的扩增反应以放大这些产物(图1)。最终得到的产6胞中种类数少表达量较高的miRNA是有效的，但对于其中种类数巨大但丰度很低的一些小但任何一种方式都无法完全或者有效的清除接头自连产物，使得单细胞小RNA文库构建困[0007]常用的小RNA建库方法以及常用的建库试剂盒，其需求的初RNA测序方法Small_seq，并研究了初始胚胎干细胞和活化胚胎干细胞中小RNA的表达差异能完全解决单细胞小RNA文库构建的中存在的问题，而是分别在灵敏度或数据质量上做了单细胞小RNA文库构建的重点问题，极大的限制了微量样本及单细胞中小RNA的高通量测[0009]本发明的目的在于提供一种小RNA文库制备过程中去除接头自连产物的方法，包7慢退火条件为75±5℃孵育2±0.5分钟，缓慢降温至60±5℃,在60±5℃条件下为30±1℃连接反应6±0.2个小时然后4±18[0039]在本发明的第二方面，提供一种小RNA文库制备过程中去除接头自连产物和污染[0041]在一种或多种实施方式中，所述sgRNA包括如SEQIDNO:14所示核苷酸序列的[0043]本发明所述的小RNA文库制备过程中去除接头自连产物的方法或本发明所述的小[0051]D&L酶切模块，所述D&L酶切模块包含D&L酶且用于去除3’末端连接模块产生9[0054]第一次扩增模块，所述第一次扩增模块包含DNA扩增所需的酶且用于以所述反转[0056]第二次扩增模块，所述第二次扩增模块包含DNA扩增所需的酶且用于对酶切产物[0057]在一种或多种实施方式中，所述反转录引物(RTP)的浓度是3’端接头浓度的2~所述小RNA文库通过本发明所述的小RNA文库的制备方过程中去除接头自连产物的方法、小RNA文库制备过程中去除接头自连产物和污染核酸的[0072]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见[0074]本发明方法ehancedCas不同的扩增循环数。同时每种接头用量和扩增条件的组合分别测试了添加和不添加RNA/RTP变性退火过程。O代表originalversion，添加了RNA/RTP变性退火的版本；S代表接头连接条件和自连产物去除策略的测试跑胶结果。泳道1_5的结果说明仅使用反转录引于1个小时可以取得比较好的效果。泳道9_11结果说明22℃孵育两个小时具有最少的接头文库的PAGE胶电泳质检。Cas9处理条件为37℃2个小时，未处理样品中除了不添加Cas9酶文库并使用PAGE胶质检，结果显示所有的样品均能观察到清晰的140bp的miRNA文库的条梯度稀释的293FT总RNA、单个或半个293FT细胞构建的小RNA文库中检测到的miRNA种类的半个293FT细胞构建的小RNA文库中miRNA表达在重复样品间具有例70％、可比对序列比例49％、mRNA比例1610pg293FT细胞总RNA组：可用序列比例稀释的小鼠睾丸总RNA中检测到的miRNA(左图)和piRNA(右图)丰度的Perason相关性热图。到的比例从高向低排列。列(e)和可检测到的miRNA种类(f)三个方面soRibo_seq与参考数据scRibo_[0100]a、野生型(WT)和PIWIL1敲除(PIWIL1KO)金黄地鼠卵细胞PIWIL1IP文库跑胶检分配和测序方法本身的差异(技术变异)；而细胞间差异则更多的来自于细胞本身的异质相似度。右侧为挑选的一个单细胞的两部分中mRNA表达的散点图。RPM表示readsper[0109]从是否来源于细胞内的角度，所述RNA可以是细胞内的RNA，也可以是细胞外的检测灵敏度足够高才能有效的获得完整的单个细胞中小RNA的信息。通过提升接头浓度能[0116]本发明人经过深入的研究，提供了一种小RNA文库制备过程中去除接头自连产物列过程中使用的连接酶具有极低的单链RNA和双链DNA的连接活性，阻碍了3’接头/RTP退火条件为75±5℃孵育2±0.5分钟，缓慢降温至60±5℃,在60±5℃条件下孵育2±为30±1℃连接反应6±0.2个小时然后4±1[0139]在一种或多种实施方式中，所述D&L酶处理的时间为先60±15分钟，后60±15分[0141]在一种或多种实施方式中，所述步骤a1)中，对应10pg_100ngRNA，使用15_75[0143]小RNA文库构建过程中5’接头(RNA)与3’接头(DNA)连接后产生的副产物为RNA_[0149]在一种或多种实施方式中，所述Cas_sgRNA复合物通常含有具有核酸内切酶活性复合物通过sgRNA的配对区与靶标DNA中的模板链进行互补配对，由Cas在特定位置将双链[0150]在一种或多种实施方式中，Cas蛋白可以是本领域周知的各种具有核酸内切酶活Cas9(SpCas9)、来自金黄色葡萄球菌的Cas9(SaCas9)，以及来自嗜热链球菌的Cas9[0153]在一种或多种实施方式中，当Cas蛋白是具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白及其变[0154]在一种或多种具体的实施方式中，所述小RNA文库制备过程中去除接头自连产物[0163]Cas_sgRNA复合物处理的方法，可参考例如CN107488655B，此处全文引入[0166]在一种或多种实施方式中，所述小RNA文库制备过程中去除接头自连产物和污染[0174]在一种或多种实施方式中，当Cas蛋白是具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白及其变[0178]通过本发明所述的去除接头自连产物和污染核酸的方法中的步骤a)～步骤c)去[0186]在另一方面，本发明还提供了一种构建小RNA文库的试剂盒。根据本发明的实施[0189]D&L酶切模块，所述D&L酶切模块包含D&L酶且用于去除3’末端连接模块产生[0192]第一次扩增模块，所述第一次扩增模块包含DNA扩增所需的酶且用于以所述反转[0194]第二次扩增模块，所述第二次扩增模块包含DNA扩增所需的酶且用于对酶切产物盒；测序装置，所述测序装置用于对通过所述试剂盒对所述样本构建的小RNA文库进行测效地确定微量样本(>10pgRNA)中的[0204]本发明的一方面，提供了含有根据本发明所述的小RNA文库制备方法制备获得的种或多种实施方式中，所述多组学测序文库所述多组学测序文库的其他组学包括但不限[0207]本发明的另一方面，还提供了根据本发明所述的小RNA文库制备方法或根据本发[0217](9)方法的高灵敏度和可重复性，为其他相关测序方法提供了底层文库构建技术[0229](5)PCR下游引物[0230]5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA_3’[0232]5’TAATACGACTCACTATAGGAGTTCTACAGTCCGACGATCGTTTTAGAGC_3’[0234]5’TAATACGACTCACTATAGGACCCGAGAATTCCAGATCGTGTTTTAGAGC_3’[0236]5’TAATACGACTCACTATAGGTCCGACGATCTGGAATTCTCGTTTTAGAGC_3’[0240]5’ppp_rArGrTrTrCrTrArCrArGrTrCrCrGrArCrGrArTrCrGrTrTrTrTrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArG[0242](11)体外转录的去除接头自连的sgRNA序列2(SEQIDNO:11，由T7体外转录制备[0243]5’ppp_rArCrCrCrGrArGrArArTrTrCrCrArGrArTrCrGrTrGrTrTrTrTrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArG[0246]5’ppp_rTrCrCrGrArCrGrArTrCrTrGrGrArArTrTrCrTrCrGrTrTrTrTrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArG[0249]5’TAATACGACTCACTATAGGCAACGCGAAGAACCTTACCTGTTTTAGAGC_3’[0251]5’ppp_rCrArArCrGrCrGrArArGrArArCrCrTrTrArCrCrTrGrTrTrTrTrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArG[0254]5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G_3’[0256]5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN_3’[0258]5’AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT_3’[0260]5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCTCGTCGGCAGCGTC_3’[0262]5’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGG_3’[0264]5’TAATACGACTCACTATAGGGUUCUGAUAACCCACUACCAUGTTTTAGAGC_3’[0266]rGrGrUrUrCrUrGrArUrArArCrCrCrArCrUrArCrCrArUrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUr[0268]实施例中所用到的HEK293T、HEK293FT和Hela细胞培养于添加10％血清的DMEM培为0.2％TritonX_100和1U/μl的RiboLockRNA酶抑制剂(购自ThermoFisher公司)。使用[0271]细胞总RNA提取：使用Trizol试剂(购自ThermoFisher公司)并按其说明进行操末端引物(表1)从质粒模板上扩增并回收D合酶(购自ThermoFisher公司)体外转录4个小时，随后使用Trizol抽提RNA，NanoDrop[0287]PCR预扩增：加入包含1×Q5反应缓冲液、0.2mMdNTPs、1.25μMFPI引物(SEQIDNO:4，生工生物合成)和0.8UQ5热启动高保真DNA聚合酶(购自NEB公司)的预扩增反应[0288]Cas9/sgRNA复合物处理：得到的预扩增产物加入包含1×Cas9反应缓冲液(购自NEB公司，货号T1030S)浓缩并使用6％的聚丙烯酰胺凝胶回收合适大小(135bp～180bp)的[0294]模板转换：加入7μl的包含0.50μlProtoscriptII反转录酶、0.25μlRiboLock[0297]文库定量和质检：使用DNA高灵敏试剂盒和Qubit对全长文库进行定量，使用DNAHSD5000ScreenTapeassaykit(购自安捷伦公司，货号5067_5593)对DNA文库的大小小进行质检，高质量的全长DNA文库大小分布为300～1000bp，主要的峰值集中于400~[0303]小RNA测序的原始数据使用cutadapt去除接头序列并过滤低质量的数据(Martin,snRNA比对。其中miRNA的鉴定标准为能够匹配到已经注释过的、成熟的miRNA序列2013)，基因表达使用RSEM工具计算基因表达量，转录组注释来源于Gencode数据库(V29)[0306]有研究发现提升体系中接头(adaptor)的用量可提升连接的效率(Faridani一些低表达的miRNAs(图2b)。以上结果说明了接头浓度的提升确实可以提升连接的效率，因此在连接反应前一般需要将RNA热变性并立即放置在冰上以保持其松散的结构。而随后[0309]发明人测试了3种不同的3’接头连接条件，分别是22℃孵育2个小时(Yang[0320]无论是之前的研究(Hagemann_Jensenet.al..,2018)还是发明人自己的结果都[0321]为了测试当前策略的效果，发明人使用20pg293细胞总RNA构建了小RNA文库。连产物(图4b，泳道1_5)。而在此基础上再添加比较严重，使用5pgRNA得到的YRNA文库的条带已经几不可见，其文库的模式也和未加入[0327]使用Cas9处理文库时一个必须谨慎对待的问题是Cas9切除接头自连产物的同时了Cas9处理与不处理文库的miRNA种[0331]连接效率的提升会导致文库极易受到外源或内源污染的RNA的干扰。细胞中存在会影响到目的小RNA的检测，导致文库构建的失败或者数据的浪费(Hagemann_Jensen[0332]测序结果显示污染的RNA都来源于同一条rRNA，因此发明人针对这条rRNA设计了[0333]以上结果说明了eCas_seq可灵活的通过添加相应的sgRNA去除内源和外源的污染[0335]为了评估eCas_seq的灵敏度(sensitivity)，鲁棒性(robustness)和再现性相似的文库模式。随着RNA投入量的降低，接头自连的量始终在合理的范围内。使用低于[0337]293FT细胞总RNA、单细胞和半细胞的文库的测序结果显示，随着RNA投入量的降低，检测到的miRNA种类数在逐渐的下降。单个293FT细胞平均可检测到215种miRNA，和[0338]以上结果说明，eCas_seq最低可使用10pg细胞总RNA或半个细胞为起始材料检测[0341]测序结果显示，使用3/4和1/2个细胞构建的文库具有相当的可用序列(useful失。此时可检测到的miRNA种类数为220种左右，占全部可检测的miRNA种类的一半以上。piRNA的结果与miRNA基本相似，区别在于不同RNA投入量的文库之间的差别更加明显(图[0350]为了与以往微量的小RNA建库方法比较，发明人同时使用NEBNext小RNA文库构建方法(NEB公司，货号E7330S)、SA_seq法(可参考2016_ScienceAdvance_HighlysensitivesequencingrevealsdynamicmodificationsandactivitiesofsmallRNAsinmouseoocytesandearlyembryos)和Cas9_seq法(2019_NatureCommunication_Single_cellCAS_seqrevealsaclassofshortPIWIinteracting[0351]测序结果显示，eCas_seq即使仅使用100pg总RNA就可以得到比NEBNext方法使用[0354]此前报道了两种可用于单细胞小RNA测序的方法，分别为Small_seq和Wang_seq单细胞小RNA文库的数据和使用Wang_seq构建的K562单细胞小文库的数据，并使用eCas_seq分别构建了293FT和K562的单细胞小RN[0355]与Small_seq相比，在相同的测序深度下eCas_seq可多获得接近一倍的可用序列[0356]以上结果说明了eCas9在单细胞上的表现从文库的质量到检测的灵敏度全面优于的膜结构，大小不一(从40nm到10μm)，由磷脂双分子层膜包裹(Ciardielloet.al..,2016)，可以作为转移生物活性分子的载体，运输蛋白质、脂质、DNA和RNA(Turturici[0360]胶图结果和测序结果都显示经过处理后ysRNA占比大幅下降，且该处理并不影响集，材料需求大，无法应用于珍贵的样品，比如卵细胞。而近期发表的scR