T-CVMA 285-2025 牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光PCR检测方法

T/CVMA285—2025牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光PCR检测方法Detectionmethodofduplexreal-timefluorescencePCRassayforBrucella2025-9-30发布2025-9-30实施中国兽医协会发布I请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利张旭、剡文亮、刘洁琼、苏贵成、吴镜、谭庆辉12规范性引用文件GB/T6682分析实验室用水NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-timepolymerasechainBHQ：无荧光淬灭基团（Blackholequencher）bp：碱基对（Basepair）Bru：牛布鲁氏菌（Brucellabovis）Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数（CyclethreshoDNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）Mtb：牛分枝杆菌（Mycobacteriumbovis）5.1试剂24%氢氧化钠、柠檬酸钠－磷酸缓冲液、4%硫酸溶液，配方见接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（pH8.0）。每6mL血液加1mL抗凝剂。3组织，放在含有保护液（50%甘油生理盐水）。组织样品应不少于2g，用灭菌容器密闭采集混有黏液、血液、黏膜的粪便，或用刮匙从动物直肠深部(约30cm)取少直接取液体培养基培养的菌液；对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量(低温冰箱保存。-20℃保存不超过三个月；-80℃以下可长取1mL~2mL全血样品，15000g离心10min，弃上清。加等体积灭菌双蒸水充分振荡，15000g离mol/L磷酸缓冲液（pH7.6充分振荡混匀。将沉淀悬浮液移入微量离心管，14取适量组织样品（剔除脂肪、被膜），剪碎，按1:5的比例加入柠檬酸钠-磷酸缓冲液（例如，1g），上清，重复本步骤1次。收集沉淀物置-20℃），分振荡混匀，15000g离心10m8样本提取b）将液体吸入吸附柱中，12000×g离心30s；e）弃去收集管中液体，12000×g离心2min，以除去残留的洗涤液；f）将吸附柱移入新的1.5mL无菌离心管中，向柱中央加入洗脱液60µL；g）室温静置2min，12000×g离心1min，离心管中液体为模板DNA。得到的核酸模板尽量在2h内8.2若使用DNA试剂盒提取DNA，则按试剂盒说明书进行操作。也可采用其他等效的DNA提取方9.1反应体系牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光定量PCR反应体系配置59.2反应程序牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光PCR反应程<Ct值≤35，此时应对样本进行重复检测。如重复实验结果仍为32＜Ct值≤35，且出现典型S型扩增6A.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（pH8.0）称取18.61g乙二铵四乙酸二钠，溶于80mL双蒸水中，搅拌至完A.30.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.6）称取34.00g氯化钠、6.20g磷酸氢A.44%氢氧化钠取8g氢氧化钠，加入200mL双蒸水中A.5柠檬酸钠－磷酸缓冲液先配制pH6.8磷酸缓冲液。A液(0.拌至完全溶解后定容至0.5L。B液(0.2mol高压灭菌后贮存于4℃。A.64%硫酸溶液A.7裂解液称取118.2g异硫氰酸胍、11.6g氯化钠溶于800mL双蒸水中搅拌至完全溶解，再加入20mLpH8.0浓度0.5mol/L的乙二铵四乙酸二钠溶液，最后加双蒸水定容至1L。称取17.9g磷酸氢二钠、7.8g磷酸二氢钾、2.25g氯化钠于200mL双蒸水中蒸水定容至250mL，再加入750A.9洗脱液称取71.6g磷酸氢二钠、31.2g磷酸二氢钾于800mL双7B.1布鲁氏菌靶基因片段参考序列（GenBankAccessionNo.MN0GCCTGCCCGCTTTCGCACAGGAGAATCAGATGACGACGCAGCCCGCGCGCATGGAAGGCATGATGACGGCCTCGCCCGATATGGCCATTCTCAATCTCTCGGTGAGACCGCGCGCGAAGCCATGACCGCGAATAATGAAGCCATGACAAAAGTGCTCGGAAGGCCGGCATCGAAGATCGCGATCTCCAGACAGGCGGCATCAATATCCAGCCGATTTATGTCTATCCTGACGACAAGAACAACCTGAAAGAGCCTACCATCACCGGCTATTCTGTATCCACCAGTCTCACGGTTCGCGTGCGCGAACTGGCCAATGTTGGAAAAATTTTGGATGAATCCGGTGTTAATCAGGGCGGTGATTTGAACCTGGTCAATGATAATCCCTCCGCCGTGACGCAAGCGCGCAGTGGCCAATGCCATTGCCAAGGCGAAGACGCTTGCCGACGGCTTGGCCGTGTGGTGGAAATCAGTGAACTGAGCCGCCCGCCCATGCCGATGCCGGACAGTTCAGAACCATGCTAGCAGCCGCACCGGACAATTCCGTGCCGATACAGCTATAACGTATCGGTCAATGTCGTTTTTGA-3'注：下划线部分为连入pMD－19T载体B.2牛分枝杆菌靶基因片段参考序列（GenBankAccessioTCCTGCGGGCTTTGCCGCGGGTGGTCCCGGACAGGCCGAGTTTG注：下划线部分为连入pMD－19T载体中的包含牛分枝杆菌目标检测片段种阳性质粒浓度，并按下面公式将浓度换算成拷贝数×10-9]/（DNA碱基数×660经计算并将重组质粒标准品的拷贝数调为1.0×108拷贝/89反向引物Bru－R探针Bru－PFAM－TCTCCAGACAGGCGGCATCAATATCC－BHQ反向引物Mtb－R探针Mtb－PHEX－CTGGCCACCTCGATGCCCTCAC－BHQ双重实时荧光PCR反应体系见表D.1。表D.1双重实时荧光PCR反应体系体积(μL）终浓度(μM）2×ProbeqPCRMix0.500.20引物Gdh-R引物Bru－R0.500.200.400.270.600.270.600.800.322.025.0注：1.此反应体积以2×ProbeqPCRMix为例，如果使用其他等效试剂，请遵照试剂说明书配液