基因工程细胞因子

基因工程细胞因子基因工程细胞因子第1页第一讲基因工程细胞因子类

药品介绍基因工程细胞因子第2页

基因工程细胞因子类药品是利用DNA重组技术生产一个蛋白质类药品。它是随DNA重组技术发展而出现新型药品。利用基因工程技术,大家能够创造出崭新产品、生产出过去常规技术难以取得大量产品或更有效地生产现有产品。最先应用基因工程技术产业领域就是制药业,而其产品主要又是细胞因子。基因工程细胞因子第3页一.人类细胞因子

基因工程细胞因子第4页1．慨念（1)细胞因子是体内细胞之间相互作用主要介质，在机体免疫应答、炎症反应、造血功效，乃至胚胎发生、生长发育等各个方面都起着关键作用。（2)是一大类调整细胞功效蛋白质，其种类繁多。而且伴随大家对其研究深入不停有新组员发觉。（3)曾用名单核细胞因子、淋巴介素、白细胞介素等等。现已将各种能调整免疫系统因子如白细胞介素类及生长因子类统称为细胞因子。（4)细胞因子是一类化学信使，含有许多共性和特征，有别于如激素类其它活性蛋白，全部细胞因子都是低分子量多肽，其分子量普通小于80KD，常有糖基化修饰。基因工程细胞因子第5页2．功效及作用（1)细胞因子能调整细胞生长，其中有些含有抑制生长或细胞毒作用，还有一些能刺激各种细胞增殖，所以也称之为生长因子。（2)细胞因子作用方式是以自分泌方式作用于分泌它们细胞，或以旁分泌方式作用于附近细胞。其作用是首先和细胞表面受体结合，然后把信号传递到细胞核，从而触发或者抑制一些基因转录，最终改变细胞中蛋白质合成模式。这些分子水平改变造成细胞行为发生改变。如细胞增殖、生长抑制、杀灭肿瘤细胞活性增强和抗体产生增加等。（3)是一个多功效调整剂，它们相互之间关系错综复杂。它们在体内作用不是孤立,由一个复杂细胞因子网络组成。在该网络中,一个细胞因子产生将影响其它细胞因子产生或影响细胞对其它细胞因子反应。（4)细胞因子或其受体异常增多、降低，异常分布或细胞因子网络失衡经常与疾病相关。基因工程细胞因子第6页二.基因工程细胞因子类药品现实状况

基因工程细胞因子第7页1.因为基因工程药品含有广泛应用价值和发展前景，即使研究开发前期投资很高，但其产品增值量大，产品投放市场后能较快收回研究开发成本，可很快产生巨大经济效益。这就极大地促进了生物技术企业发展。基因工程细胞因子第8页2．当前发展起来基因工程细胞因子药品主要有：干扰素（α、β、γ)胰岛素生长因子白细胞介素（IL)系列肿瘤坏死因子（TNF)促红细胞生成素（EPO)集落刺激因子（G-CSF、M-CSF、GM-CSF)表皮生长因子（EGF)血小板生长因子（PDGF)成纤维细胞生长因子（FGF)神经生长因子（NGF)结蹄组织生长因子（CTGF)及心钠素等。基因工程细胞因子第9页3.现在美国FDA同意上市基因工程细胞因子药品有α、γ干扰素、EPO、G-CSF、GM-CSF、IL-2等10各种，另外还有各种白介素、集落刺激因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素生长因子、干扰素等数十种产品已分别进行I、II、III期临床研究，逐步投放市场。基因工程细胞因子第10页4．我国基因工程药品开发研究自80年代末开始兴起，90年代逐步进入发展高峰，重点研制和开发基因工程细胞因子药品有干扰素、新型干扰素（α、β、γ）、促红细胞生成素（EPO）、白细胞介素2、新型白细胞介素2、白细胞介素3、4.6、11、12、13、肿瘤坏死因子、集落刺激因子（G-CSF、M-CSF、GM-CSF）、人表皮生长因子、人血小板生长因子、结蹄组织生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、成骨细胞生长因子、血管生成抑制因子、甲状旁腺素及水蛭素等。基因工程细胞因子第11页5.集落刺激因子是当前我国研制开发最为活跃重组细胞因子，前后已经有十余家研制成功G-CSF及GM-CSF取得新药证书和生产文号，投放市场。基因工程细胞因子第12页

三

．

主要细胞因子药品1．

重组人干扰素（rHuINF)2．

重组人白细胞介素（rHuIL)

3．

重组人集落刺激因子（rHuCSF)基因工程细胞因子第13页1．重组人干扰素（rHuINF）（1）

干扰素是一组多功效细胞因子，依据其结构和起源分为INF-α、INF-β、INF-γ三种。（2）

干扰素α为多基因产物，分为α1.α2…等许多亚型。干扰素α和β基因结构及功效相同，其氨基酸组成上有近30%同源性，并结协议一受体，在临床上作用较为靠近。（3）

干扰素γ与前二者在结构及功效上有很大差异，在氨基酸水平上有99%差异，分子中无二硫键。INF-γ是一个免疫干扰素，主要作用是参加免疫调整，与INF-α和INF-β有协调作用。基因工程细胞因子第14页（4)干扰素α和β分别由白细胞和成纤维细胞产生。干扰γ主要由活化T细胞、NK细胞产生。当前干扰素基因工程药品有IFN-α1b、-α2a、-α2b及IFN-γ。

（5)临床应用α1b主要含有抗病毒作用，用于治疗乙型及丙型肝炎；α2a主要用于毛细胞白血病和卡波氏肉瘤；α2b用于多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、毛细胞白血病及喉乳头状瘤；IFN-γ除含有抗病毒和抑制细胞生长活性外，主要是对免疫系统作用，临床应用于宫颈癌、生殖器疣、慢性肉芽肿和病毒感染及一些肿瘤。

基因工程细胞因子第15页2．重组人白细胞介素（rHuIL)

（1)白细胞介素为介导白细胞间相互作用一类细胞因子。

（2)另外，还参加其它细胞相互作用，如造血干细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、成骨及破骨细胞等。基因工程细胞因子第16页

（3）至今已发觉和命名有白介素1至18，还将有更多白介素被发觉。IL-1、IL-6、IL-8由单核巨噬细胞或成纤维细胞产生;IL-7和IL-11由骨髓基质细胞产生;IL-10和IL-12由B细胞产生;

其余IL均由活化T细胞产生。

（4）当前重组IL研制和开发发展很快，其中主要有IL-2、IL-1、IL-3、IL-4.IL-6、IL-11、IL-12、IL-13和IL-18。正式同意生产仅有天然IL-2和新型IL-2两种。IL-1、IL-3、IL-4和IL-6国外已进入临床试验，有已进入试生产。当前正在试验室研究阶段有IL-11、IL-12、IL-13和IL-18，其中有已进入中试阶段。这些类型白介素我国也正在开发研究之中。

基因工程细胞因子第17页3．重组人集落刺激因子（rHuCSF)

（1)集落刺激因子（ColonyStimulatingFactor)是一组控制粒细胞、单核-巨噬细胞及相关造血细胞增殖和分化糖蛋白。

（2)有四种不一样CSF，即粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)和多潜能集落刺激因子（Multi-CSF),后者又称为白细胞介素3。这四种CSFDNA序列和氨基酸序列没有同原性，其作用细胞受体也不相同。现除M-CSF外，其余3种CSF重组产品均已研制成功，G-CSF及GM-CSF重组制品已大量投放市场。基因工程细胞因子第18页

（3)以GM-CSF为例，人GM-CSF全基因长约2.5kb,含有4个外显子和3个内含子，定位于人第5号染色体长臂IL-3基因下游。非糖基化GM-CSF由127个氨基酸组成，rHuCSF分子量为14500。1985年克隆到人GM-CSFcDNA，并在哺乳类动物细胞中得到表示。

（4)临床作用及应用情况

rHuCSF能促进骨髓内嗜中性粒细胞、单核细胞、巨核细胞系发育、成熟和增殖，增加外周血成熟粒细胞、单核吞噬细胞功效，增强T细胞介导细胞毒作用，并对免疫效应细胞产生复杂调整作用。

主要用于肿瘤化疗和放疗后所致造血障碍、艾滋病、骨髓移植、骨髓异常增生综合症(MDS)、再生障碍性贫血及免疫功效低下等症治疗。基因工程细胞因子第19页四.结语基因工程细胞因子第20页

伴随基因工程细胞因子类药品不停深入研究及开发，已经显示出其辽阔应用前景及巨大社会效益与经济效益。其发展带动了整个制药业快速发展。

1、重组新发觉与人类疾病亲密相关细胞因子，开发新药；2、现有产品从基因改造到载体和菌种选择、构建高效表示系统及革新发酵、纯化程序，提升产量降低成本；3、扩充临床应用及与其它药品联合使用；4、构建双基因表示系统即细胞因子融合蛋白，扩充临床应用范围，并可提升其生物学作用10到20倍。5.在肿瘤治疗方面应用发展很快，出现了新希望。

能够预见，伴随分子生物学技术迅猛发展，基因工程细胞因子类药品在新世纪中将会显示出更为主要作用。基因工程细胞因子第21页

第二讲用于治疗肿瘤基因工程细胞因子基因工程细胞因子第22页细胞因子与肿瘤

一、细胞因子与肿瘤发生亲密相关二、细胞因子与肿瘤转移

三、可望用于肿瘤治疗细胞因子

四、结语基因工程细胞因子第23页

•

肿瘤流行病学研究揭示,肿瘤是一个细胞后代经过各自互不依赖改变,多步骤累积而产生结果。恶性细胞转化关键是从正常生长调控机制中摆脱。转化细胞生长因子依赖性和接触性抑制丧失。基因工程细胞因子第24页•细胞因子是由造血系统、免疫系统或炎症反应中活化细胞产生能调整细胞分化、增殖和诱导细胞发挥功效,含有高活性多功效低分子量多肽、蛋白质或糖蛋白,细胞因子单体分子量从5KD到60KD不等,普通不超出80KD。细胞因子之间相互诱导、相互调整、相互拮抗、相加或协同作用组成了细胞因子网络。细胞因子网络调整作用在免疫应答和炎症反应发生、发展和转归、造血系统分化发育以及肿瘤发生、发展等方面起着主要作用。

基因工程细胞因子第25页•肿瘤发生、发展和细胞因子有着密不可分联络。许多细胞因子参加了肿瘤发生和转归信号传递路径。有癌基因则与细胞因子或是细胞因子受体基因有同源性。另首先,许多细胞因子则又含有抑制细胞转化,阻止恶性细胞转移或者是直接杀伤肿瘤细胞能力。基因工程细胞因子第26页一、

细胞因子与肿瘤发生亲密相关基因工程细胞因子第27页•研究已经发觉了很多生长因子型癌基因,它们包含v-sis,int-1与int-2以及hst等各种癌基因。1.v-sis基因---猿猴肉瘤病毒癌基因.2.int-1与int-2癌基因---逆转录病毒整合位点。3.人hst基因---人类胃癌或kaposi肉瘤中寻找新癌基因时发觉。•另外,一个别生长因子基因在一定条件下可能起到癌基因作用。这些基因包含FGF-5基因,碱性FGF基因,TGF-α基因,EGF基因等。

基因工程细胞因子第28页二、细胞因子与肿瘤转移基因工程细胞因子第29页

•肿瘤侵袭是一个主动过程,需要肿瘤细胞运动。1.自泌运动因子(AMF)--刺激肿瘤细胞运动,如黑色素瘤自泌运动因子。2.胰岛素样生长因子(IGF)--刺激人黑色素瘤细胞.3.神经生长因子(NGF)--刺激小鼠胚胎癌细胞.基因工程细胞因子第30页三、可望用于肿瘤治疗细胞因子

基因工程细胞因子第31页•已经证实很多细胞因子含有治疗肿瘤作用,包含IFN-α,IFN-γ,IL-2,IL-4,IL-6,IL-12,IL-18,GM-CSF,G-CSF,M-CSF,TNF-α等,其中IFN-α,IFN-γ,IL-2,GM-CSF,G-CSF,TNF-α已同意上市用于肿瘤治疗。

基因工程细胞因子第32页表1:用于治疗肿瘤细胞因子现实状况制剂名称

制剂名称

开发厂家

适应症(开发觉实状况和时间)IL-2日盐野义,美Chiro血管肉瘤(上市92)，肾细胞癌(Ⅱ94),HIV（Ⅲ96)IL-3SENDO小细胞肺癌化疗后血小板降低(Ⅲ95)IL-3/GM-CSF美Immunex肉瘤化疗后造血（Ⅱ94)IL-3/白喉毒素

美Minnesoda大学

急性髓样白血病（开发96)IL-4美先灵

非小细胞肺癌，胃癌，HIV(Ⅲ96)IL-6美SeronoLab.多发性骨髓瘤，急性髓样白血病（Ⅱ96)IL-6/白喉青素

美Seragen骨髓瘤Kaposi肉瘤（临床前研究93)IL-7瘤苗

美TargetedGenetics恶性黑色素瘤（Ⅰ96)IL-11山之内，美Genetics化疗,放疗后血小板降低(Ⅲ96,FDA生产认可审查)IL-12山之内,美Genetics瑞士Hoffmann-La,抗癌,HIV(临床试验96)

肾细胞癌(临床试验95)基因工程细胞因子第33页制剂名称

开发厂家

适应症(开发觉实状况和时间)IFN-α2a美Hoffmann-La,日武田

抗癌(上市,适应症增加或同意生产部门88-96)IFN-α2b日先灵等

抗癌

慢性髓样白血病,多发性骨髓瘤(上市,适应症增加88-92)IFN-β美Scrono恶性肿瘤(II96)IFN-γ美Connective,美Vlagene,神经母细胞瘤(I95),

日

盐野义

肾细胞癌(上市90)GM-CSF美ImmunexHIV(III96)M-CSF日

绿十字

肿瘤化疗后中性粒细胞降低(上市91)G-CSF日

中外制药、麒麟啤酒,抗癌(肺,卵巢,睾丸,淋巴瘤等)(上市91)

美AmgenEPO(静脉注射)日

中外制药

多发性骨髓瘤(新适应症93-95)TNF(局部用药)美Genetics;肉瘤,恶性黑色素瘤(Ⅲ95);

日旭化成工业;大日本制药

脑肿瘤(申请准备中);皮肤癌(同意生产90)基因工程细胞因子第34页

表2细胞因子基因治疗情况细胞因子

载体

导入方式

治疗疾病IL-2逆转录病毒

本身肿瘤细胞

晚期肿瘤,脑肿瘤,肠癌,小细胞肺癌,

成纤维细胞

骨髓瘤,肾细胞癌,神经胶质瘤

胸腔注射

肺癌

腺病毒

本身肿瘤细胞

神经胶质瘤

瘤体内注射

肠癌,肺癌

脂质体

本身肿瘤细胞

晚期肿瘤,乳腺癌,卵巢癌,

成纤维细胞

前列腺癌

胸腔注射AAV本身肿瘤细胞

卵巢癌,前列腺癌IL-2+IFN-

逆转录病毒

本身肿瘤细胞

晚期肿瘤IL-4逆转录病毒

本身肿瘤细胞

晚期肿瘤,脑肿瘤,骨髓瘤IL-7逆转录病毒

本身肿瘤细胞

骨髓瘤IL-12逆转录病毒

成纤维细胞

晚期肿瘤

基因工程细胞因子第35页1．干扰素系列

干扰素是一族含有抗病毒，影响细胞生长、分化和调整免疫功效等活性蛋白质。依据干扰素蛋白质氨基酸结构，抗原性和细胞起源，可将其分为三类:IFN-α，IFN-β，IFN-γ。干扰素是得到FDA同意用于临床治疗肿瘤第一个细胞因子。研究已证实IFN-α，IFN-γ含有治疗肿瘤作用。基因工程细胞因子第36页•IFN-α是一组能够诱导一系列细胞内蛋白表示,继而发挥抗病毒,抗细胞增殖和调整免疫应答细胞因子。•当前,我国生产IFN-α制剂主要是重组人IFN-αD,IFN-αA。1989年,预防医科院病毒所和长春生物制品所合作,IFN-α1投入工业化生产。

基因工程细胞因子第37页•IFN-α主要功效包含抗病毒，抗细胞增殖和免疫调整。FDA已同意IFN-α用于治疗毛细胞白血病，AIDS病kaposi肉瘤，黑色素瘤，尖锐湿疣，慢性丙型肝炎，亚急性硬化性脑炎和T细胞白血病。

在IFN-α临床研究方面，它被首选取于治疗肿瘤，主要应用于：

（1)造血系统恶性变和淋巴瘤--白血病.多发性骨髓瘤

（2)实体瘤--黑色素瘤.肉瘤.胃肠道肿瘤.肾细胞癌基因工程细胞因子第38页2.白介素系列

当前已知可能含有治疗肿瘤作用白介素主要包含：IL-2，IL-4，IL-6，IL-12，IL-18等，而对于它们在肿瘤治疗方面研究多仅限于临床试验，只有及少数因子取得上市用于肿瘤治疗。

基因工程细胞因子第39页(1)IL-2IL-2临床应用主要包含两方面:一是IL-2单独或与其它细胞因子适用治疗疾病，二是用IL-2诱导淋巴细胞(LAK或TIL)进行过继免疫疗法。•已用IL-2治疗肿瘤包含:卵巢癌，乳腺癌，神经母细胞瘤，髓样母细胞白血病，内分泌肿瘤，小细胞肺癌和非小细胞肺癌，毛细胞白血病，鳞状细胞癌，膀胱癌，神经胶质瘤，霍奇金淋巴瘤，肉瘤和肝细胞癌等。只有肾细胞癌取得同意治疗。•利用IL-2自体瘤苗，腺病毒介导IL-2基因治疗以及IL-2与肿瘤浸液淋巴细胞共同治疗癌症已成为研究热点。尤其是利用CD8(+)肿瘤浸液淋巴细胞合并重组IL-2治疗转移肾细胞癌研究已进入Ⅲ期临床。基因工程细胞因子第40页（2)IL-12

•IL-12主要由活化巨噬细胞，树突状细胞和中性粒细胞产生，有致炎作用和免疫调整作用。•当前国外对于IL-12研究主要着眼于表示IL-12自体肿瘤疫苗和表示IL-12重组腺病毒载体所介导抗肿瘤免疫两个方面。

基因工程细胞因子第41页（3)IL-18

•IL-18主要生物学活性是诱导Th细胞产生IFN-γ，诱导T细胞产生GM-CSF，促进T细胞增殖和增强NK细胞活性。

基因工程细胞因子第42页•IL-18能经过抑制血管生成切断肿瘤营养供给，从而造成肿瘤细胞死亡，IL-18尚可促进Fas配体表示，经过Fas-FasL路径介导肿瘤细胞凋亡。•当前对IL-18治疗肿瘤研究依然停留在小鼠水平，主要方法是利用IL-18,IL-12,IL-1,IFN等几个细胞因子进行合并治疗。有两种方法:一个是合并几个细胞因子cDNA进行基因治疗，另外一个是使用IL-12进行基因转染，同时使用IL-18进行全身注射。基因工程细胞因子第43页3.集落刺激因子系列•集落刺激因子为能诱导骨髓细胞或造血细胞在半固体琼脂系统中呈克隆生长细胞因子,包含G-CSF,M-CSF,GM-CSF。

基因工程细胞因子第44页(1)GM-CSF

GM-CSF能促进骨髓和外周血干细胞扩增和转运,诱导中性粒细胞增加,另外,它还能经过促进肿瘤细胞分化,补充白细胞数量以增加化疗药品疗效和增强机体免疫能力到达抗肿瘤目标。基因工程细胞因子第45页

（2)G-CSF

•G-CSF主要作用是促进骨髓造血细胞增殖分化形成粒细胞集落,诱导中性粒细胞终末分化和增强中性粒细胞功效。

•对G-CSF用于治疗髓样白血病和AML进行了临床研究。发觉AML病人接收G-CSF治疗后，能刺激胚系前体细胞更新和终末分化，不过治疗效果因人而异。基因工程细胞因子第46页(3)M-CSF

•M-CSF能加速造血功效恢复,显著增加巨噬细胞数量及功效。M-CSF在动物试验中有促进肿瘤细胞分化,使白血病细胞增殖能力下降,另外它还能增强巨噬细胞对肿瘤杀伤能力。用M-CSF治疗转移性黑色素瘤病人I期临床试验表明,仅有少数病人在用药后发生肿瘤转归。用M-CSF治疗肿瘤临床试验仍需深入深入.。基因工程细胞因子第47页4.TNF•肿瘤坏死因子是能够引发肿瘤组织出血坏死，并含有多方面功效细胞因子。当前临床应用研究得较多是TNF-α。

基因工程细胞因子第48页•TNF-α主要经过对肿瘤区域血管影响引发移植肿瘤出血坏死。在临床上适用TNF-α和IFN-γ,IL-2或其它化疗药品可能有更加好效果。TNF-α临床应用研究表明TNF-α全身副作用大,应该局部用药,而且局部用药疗效也显著高于全身用药。已经利用TNF-α试治了黑色素瘤,结肠癌,kaposi肉瘤,B淋巴细胞瘤,非小细胞肺癌,卵巢癌,神经胶质瘤等基因工程细胞因子第49页5.血管生成抑制因子（endostatin,angiostatin,PgnK5)

•除了以上所介绍一些细胞因子含有治疗肿瘤作用外，还有新细胞因子不停被发觉。多年来，从小鼠肿瘤内分离到一个新血管生成抑制因子endostatin。纤溶酶原（plasminogenPgn)→angiostatin。

基因工程细胞因子第50页•血管发生在实体瘤生长维持及转移中起主要作用。当肿瘤内一细胞亚群经过血管生成因子与抑制因子相互协调作用而使其转化为血管生成表型后,肿瘤就快速生长,经过血管转移至全身各处。大