专题强化练43PCR的原理与应用

专题强化练43PCR的原理与应用授课提示：对应专题强化练123页(分值：50分)一、选择题(每题2分，共计4分)1．(2025·江西赣州二模)科研人员利用PCR技术扩增人乳铁蛋白基因，并进行电泳鉴定。下列叙述正确的是()A．目的基因扩增时，应添加的引物组合为引物Ⅰ、Ⅳ或引物Ⅱ、ⅢB．PCR循环6次可得到5种DNA分子，其中等长的DNA分子共52个C．电泳所需缓冲液和酶应分装成小份在－20℃储存，使用前在室温下解冻D．鉴定DNA时，应向提取的DNA中加入二苯胺试剂并置于沸水中加热解析：利用PCR技术扩增目的基因时，引物应与模板链的3′端互补配对，且两条引物分别结合在两条模板链上，这样才能使子链从5′端向3′端延伸。观察可知，应添加的引物组合为引物Ⅱ、Ⅲ，A错误；题图中的PCR循环6次，可以得到2种“长链/中链”DNA分子，2种“中链/短链”DNA分子，1种“短链/短链”DNA分子，共5种；其中等长DNA分子共26－2×6＝52(个)，B正确；电泳所需缓冲液应分装成小份，并在－20℃储存，使用前从冰箱拿出放在冰块上缓慢融化，C错误；鉴定DNA时，应先将提取的DNA部分溶于装有NaCl溶液的试管中，然后向试管内加入二苯胺试剂，再将试管置于沸水中加热，D错误。答案：B2．(2025·山东德州二模)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列说法正确的是()A．PCR过程中预变性与最后一次循环时，变性时间较长可使DNA充分解聚B．PCR过程中，复性温度过低会导致无法扩增出DNA片段C．DNA的电泳速率与DNA分子的大小和构象有关，与凝胶浓度无关D．将PCR产物、核酸染料和凝胶载样缓冲液混合后，用微量移液器加入加样孔解析：在PCR过程中，预变性的目的是使模板DNA完全解聚为单链，最后一次循环时变性时间较长，能确保所有的DNA双链充分解聚，为后续可能的反应提供足够的单链模板，A正确。PCR过程中，复性温度过低会导致引物与模板错配，但一般不会导致无法扩增出DNA片段，只是可能会出现非特异性扩增等问题，B错误。DNA的电泳速率与DNA分子的大小、构象有关，同时也与凝胶浓度有关。凝胶浓度越大，孔隙越小，DNA分子迁移受到的阻力越大，C错误。进行电泳鉴定时，应先将PCR产物与凝胶载样缓冲液混合，然后加入加样孔，核酸染料一般是在制胶时加入到琼脂糖凝胶中，而不是与PCR产物、凝胶载样缓冲液一起混合，D错误。答案：A二、非选择题(46分)3．(16分)(2025·广西一模)塑料的主要成分为聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)和聚丙烯(PP)等，会造成难以降解的“白色污染”。自然界有多种细菌可以降解塑料的不同成分，研究人员欲通过筛选，并利用基因工程技术培育能降解多种塑料成分的“超级菌”。(1)研究人员欲比较大肠杆菌YT1和芽孢杆菌YP1两类细菌降解PE塑料的能力，配置固体培养基，接种菌株后表层覆盖0.1mm厚的PE塑料。分组实验结果如表所示：①筛选能分解PE塑料的菌株时，应将菌株接种到以________为唯一碳源的培养基，从功能上讲，属于________培养基。②培养基3中接种混合培养后的YP1，其降解圈直径明显加大，其原因可能是________________________________________________________________________。(2)研究人员发现一种胞外酶基因A，有降解PVC塑料的功能。对A基因测序可知，其调节功能区增加一个碱基对A—T，可增强其表达能力。通过PCR定点诱变技术在体外改造A基因(如图甲)，然后构建表达载体(如图乙)，导入受体菌培育“超级菌”。注：LacZ基因编码产生的酶能分解β-半乳糖苷，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。①图甲所示，大引物b是指以________(填“引物1”或“诱变引物”)延伸得到的DNA链为模板，________(填“引物1”或“诱变引物”)与之结合延伸得到的DNA子链。获得图甲中的改良A基因至少需要________个PCR循环。②图乙中要实现质粒和改良A基因的正确连接，应选用的限制酶是________。将构建的表达载体导入受体菌后，在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的平板上培养，长出的________(填“蓝色”或“白色”)菌落是成功导入重组质粒的菌株，依据是________________________________________________________________________。解析：(1)①在筛选分解PE塑料能力大小的菌株时，应将两类菌株接种到以PE为唯一碳源的培养基，不能分解PE塑料的细菌，因为缺少营养物质碳源死亡；该培养基能筛选出能分解PE塑料的细菌，所以从功能上讲属于选择培养基。②原本YP1对PE塑料的分解能力弱于YT1，而培养基3中接种混合培养后的YP1，其降解圈直径明显加大，其原因可能是YP1菌株整合了YT1的对PE塑料分解能力更高的基因，发生了转化。(2)①观察图甲，根据大引物的方向，PCR1大引物b是指以诱变引物延伸得到的DNA链为模板，引物1与之结合延伸得到的DNA子链；经过PCR1得到大引物需要2次PCR，再利用大引物和引物2至少2个PCR循环才能获得完整的改良A基因，共需经过4次PCR。②构建改良基因表达载体时，为实现质粒和改良基因的准确连接，应选用的限制酶是XmaⅠ和BglⅡ，酶切位点在目的基因两侧，且在质粒中这两个酶切位点在启动子和终止子之间，不破坏氨苄青霉素抗性基因，复制原点等重要元件，两种限制酶，形成的黏性末端不同，所以不会出现目的基因和质粒的自我环化以及目的基因的反向连接；在含氨苄青霉素和β-半乳糖苷的平板上培养一段时间后，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是含有改良基因A的重组质粒不含有完整的LacZ基因，受体菌不能产生相应的酶，无法分解β-半乳糖苷而使培养基变蓝。答案：(1)①PE/聚乙烯选择②混合培养过程中发生了转化，YT1的对PE塑料分解能力更高的基因整合到了YP1菌株中(2)①诱变引物引物14/四②XmaⅠ和BglⅡ白色含有改良基因A的重组质粒上LacZ基因被破坏，受体菌不能产生相应的酶，无法分解β-半乳糖苷，不能产生蓝色物质4．(15分)(2025·福建龙岩一模)科研人员采用重叠延伸PCR技术，成功构建了突变的IKBA基因(以下称IKBAm)，使IKBA蛋白中第32、36位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸，阻断了IKBA蛋白的磷酸化，IKBA蛋白磷酸化与哺乳动物组织中广泛存在的某种转录因子的功能有关。该技术采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来，获得定点突变的新基因，原理如图，回答下列问题：(1)利用重叠延伸PCR技术诱变IKBA基因时，将预期的突变碱基设计在PCR的引物3和引物4中，分别进行PCR体系1和PCR体系2的扩增。PCR体系1中加入的引物是________。PCR体系1和PCR体系2必须分开进行的原因是______________________________________________________________。(2)将PCR体系1、2的产物(图中a、b和c、d)混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到55℃，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有________种结合的可能，其中能进行进一步延伸的是________组合的DNA片段。(3)质粒A上有限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，为将IKBAm与质粒A正确连接，在设计IKBAm的扩增引物时，需在引物________的5′端分别添加相应的限制酶的识别序列。下表为重叠延伸PCR引物序列表，引物3的①位置上有关的碱基序列是________(填写出6个碱基)。(4)已知IKBA基因的部分序列为：数字94、95、96、106表示碱基位置，丙氨酸的密码子：GCU、GCC、GCA、GCG，则突变引物4中省略的碱基是________(填序号)。①AGC、GGC、CTG、GAC、GCC②UCG、GGC、CTG、GAC、ACC③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC④TCG、CCG、GAC、CTG、AGG解析：(1)为了获得定点突变的新基因，采用PCR扩增时需要改变引物的部分碱基，引物是与目的基因复制起始端互补配对的单链DNA，结合题图和题干信息分析，PCR体系1需要引物1和引物3，PCR体系2需要引物2和引物4。引物3和DNA一条链互补配对，引物4和DNA对应部位的另一条链互补配对，即引物3和引物4碱基互补配对，若PCR体系1和PCR体系2混合进行，两种引物结合形成双链，引物失效则无法高效地进行PCR扩增，因此必须分开进行扩增。(2)由于引物3和引物4碱基序列互补配对，PCR扩增产物经过高温变性后会形成a、b、c、d四种单链，当温度下降到55℃，能够互补配对的DNA链相互结合，a和b结合，a和d结合，b和c结合，c和d结合，共4种结合方式。a和b结合以及c和d结合没有突出的单链部分，不能延伸，b和c结合有突出的单链部分，但是DNA延伸方向必须是从自身的5′→3′，b和c结合也不能延伸，能进行进一步延伸的是a和d组合的DNA片段。(3)由于引物3和引物4是和目的基因的中间碱基序列互补配对的，要将目的基因和质粒连接形成重组的DNA分子，则需要在目的基因的两端增加限制酶识别序列，因此需要在引物1和2的5′端分别添加相应的限制酶的识别序列。由于引物3和4是碱基互补配对的，引物4的3′端前6个碱基是AGCAGA，则引物3的①位置上有关的碱基序列是TCGTCT。(4)结合引物4的已知序列和IKBA基因的部分序列可知，引物4的碱基序列和题图中的IKBA基因的单链部分序列基本相同(除突变位点外)，已知第32位氨基酸需要是丙氨酸，根据丙氨酸对应的密码子分析，94、95、96对应的碱基是GCC，96和106号碱基之间的序列和题图相同，为GGCCTGGAC，第36位氨基酸也需要是丙氨酸，因此TCC改变为GCC，综合分析，突变引物4中省略的碱基是③GCC、GGC、CTG、GAC、GCC。答案：(1)引物1和引物3引物3和引物4存在碱基互补配对片段，置于同一反应体系会导致引物失效(或若将两个体系混合扩增，引物1和引物2同时存在，会扩增出IKBA基因)(2)4a和d(3)1和2TCGTCT(4)③5．(15分)(2025·黑龙江哈尔滨一模)金黄色葡萄球菌(简称Sa)可能引发从轻微皮肤感染到严重的全身感染，尤其对免疫力低下者危害更大。预防感染的关键在于良好的卫生习惯和合理使用抗生素。但不规范使用抗生素易出现抗药性Sa。推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以下图中R基因的上、下游片段及质粒1共同构建质粒2，然后通过同源重组(质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换)敲除Sa的R基因。(1)操作步骤如下：①根据图甲信息，质粒2的构建过程中用引物________(填数字)进行PCR扩增，每次循环一般可以分为________________三步，n次循环后可以得到等长的目的基因________个。然后选择限制酶______________对扩增产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含氯霉素的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。③将步骤②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含________的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落中分别挑取少许菌体，依次接种到含________的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因可能被敲除。(2)以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，产物一般通过________________(技术名称)来鉴定。检测结果如图乙所示，表明R基因已被敲除的是________。解析：(1)①由图甲可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因。PCR反应过程是：变性→复性→延伸，n次循环后可以得到等长的目的基因(2n－2n)个。用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacⅡ酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素的平板上，能生存下来的菌落就是含质粒2的Sa单菌落。③为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，所以将步骤②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R