CN119497749A 一种使诱导多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法、视网膜色素上皮细胞和使用该视网膜色素上皮细胞的方法 （新加坡科技研究局）

2024.09.27PCT/SG2023/0500512023.01.27WO2023/146477EN2023.08.03一种使诱导多能干细胞分化为视网膜色素本发明涉及一种使诱导多能干细胞分化成通过所述分化方法可获得的视网膜色素上皮细胞培养物和通过所述分化方法获得的视网膜色视网膜色素上皮细胞培养物组成或包含通过所述分化方法可获得或获得的视网膜色素上皮细含通过所述分化方法获得的视网膜色素上皮细通过所述方法从诱导多能干细胞分化的视网膜视网膜色素上皮细胞在受试者中的免疫原性的22.根据权利要求1所述的方法，其中所述分化培养基是3.根据权利要求2所述的方法，其中所述DMEM/F12培养基包含1xN2补充物、1xB27补充物和1xNEAA。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中通过混合以下以获得110mL的100xN2补充物；20mL的50xB27补充物；10mL的100xNEAA；和/或iii)的DKK1，优选地其中以约10ng/ml的浓度使用权利要求5i)、ii)和/或iii)的9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中以至少约0.1μM的浓度使用权利要求10.根据权利要求5至9中任一项所述的方法，其中以至少约2.5ng/ml的浓度使用权利11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中以至少约50ng/ml的浓度使用权利312.根据权利要求5至11中任一项所述的方法，其中以至少约5μM的浓度使用权利要求13.根据权利要求5至11中任一项所述的方法，其中以至少约0.5μM的浓度使用权利要求5iv)和/或v)的PD17307，优选地其中以约1μM的浓度使用权利要求5iv)和/或v)的使用权利要求5v)的CHIR99021以用于培养所述细胞，优选地培养所述细胞达约3个连续培16.根据权利要求5至15中任一项所述的方法，其中培养iPS细胞包括在第一分化培养17.根据权利要求5至16中任一项所述的方法，其中培养iPS细胞包括在第一分化培养18.根据权利要求5至17中任一项所述的方法，其中培养iPS细胞包括在第一分化培养基中培养约2天，随后在第二分化培养基中培养约2天，随后在第三分化培养基中培养约219.根据权利要求5至18中任一项所述的方法，其中培养iPS细胞包括在第一分化培养基中培养约2天，随后在第二分化培养基中培养约2天，随后在第三分化培养基中培养约220.根据权利要求5至19中任一项所述的方法，其中培养iPS细胞包括在第一分化培养基中培养约2天，随后在第二分化培养基中培养约2天，随后在第三分化培养基中培养约221.根据权利要求5至20中任一项所述的方法，其中使用LDN_193189达至少约2个培养23.根据权利要求5至22中任一项所述的方法，其中使用SU525.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中将iPS细胞在分化培养基中培养约26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其27.根据权利要求1至26中任一项所述28.根据权利要求27所述的方法，其中所述RPEM培养基包含约50％DMEM/F12和约50%最低必需培养基(MEM)，所述最低必需培养基(MEM)包含0.5xN1补充物和1xNEAA。430.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述RP31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中32.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，其33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述RPEM培养基中培养所述细胞之后纯化所述培养基中的35.根据权利要求34所述的方法，其中权利要求34a38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过在适于重编程干细胞的条件下其中在适于细胞回收的培养基中培养转染的干细胞，其中所述40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脐带羊膜的干细胞是脐带羊膜41.根据权利要求40所述的方法，其中所述脐带羊膜的间充质干细胞是间充质干细胞群，其中所述干细胞群中的至少约90％或更多的细胞表达以下标记物中的每一个：CD73、42.根据权利要求41所述的方法，其中所述间充质干细胞群的至少约90％或更多的细43.根据权利要求41至42中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞群的至少约545.一种通过如权利要求1至44中任一项所定义的方法可获得的视网膜色素上皮(RPE)46.一种通过如权利要求1至44中任一项所定义的方法获得的视网膜色素上皮(RPE)细47.一种视网膜色素上皮，其由通过如权利要求1至44中视网膜色素上皮细胞培养物组成或包含通过如权利要求1至44中任一项所定义的方法可获48.一种视网膜色素上皮，其由通过如权利要求1至44中网膜色素上皮细胞培养物组成或包含通过如权利要求1至44中任一项所定义的方法获得的49.一种药物组合物，其包含通过如权利要求1至450.根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述药物组合物适合于胃肠外或局部施51.根据权利要求45至46中任一项所述的RPE细胞52.根据权利要求45至46中任一项和/或权利要求51所述的RPE细胞培养物、权利要求47至48中任一项和/或权利要求51所述的上皮、和/或权利要求49至50中任一项和/或权利53.根据权利要求45至46中任一项和/或权利要求51至52中任一项所述的RPE细胞培养54.根据权利要求45至46中任一项和/或权利要求51至53中任一项所述的RPE细胞培养55.根据权利要求45至46中任一项和/或权利要求51至54中任一项所述的RPE细胞培养656.根据权利要求45至46中任一项和/或权利要求51至55中任一项所述的RPE细胞培养57.根据权利要求45至46中任一项和/或权利要求51至56中任一项所述的RPE细胞培养58.根据权利要求45至46中任一项和/或权利要求51至57中任一项所述的RPE细胞培养49至50中任一项和/或权利要求51至57中任一项所述的药物组合物，其中相对于从ES分化59.根据权利要求45至46中任一项和/或权利要求51至58中任一项所述的RPE细胞培养60.一种治疗受试者的视网膜退行性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用通过如权利要求1至44中任一项所定义的方法从诱导多能干(iPS)细胞分化的视网膜色素上皮61.根据权利要求60所述的方法，其中所述视网膜退行性疾病是年龄相关性黄斑变性62.一种检测视网膜色素上皮(RPE)细胞在受试者色素上皮(RPE)细胞通过如权利要求1至44中任一项所定义的方法从诱导多能干(iPS)细胞a)将通过如权利要求1至44中任一项所定义的方法从iPS细胞分化的RPE细胞引入受试63.根据权利要求62所述的方法，其中来自所述受试者的成像数据与参照成像数据相64.一种确定视网膜色素上皮(RPE)细胞在膜色素上皮(RPE)细胞通过如权利要求1至44中任一项所定义的方法从诱导多能干(iPS)细a)使用成像方法检测从所述受试者获得的样品中的促炎细胞b)将在步骤a)中接收的所述成像数据与7胞因子水平指示在所述受试者中所述RPE8[0002]本申请要求2022年1月27日提交的美国临时专利申请No.63/303,849的优先权的[0004]干细胞是一种具有无限自我更新和分化成多种细胞或组织类型的能力的细胞干细胞自我更新的能力对于其作为原始未分化细胞的储库的功能是关键的，并且干细胞的动物疾病的潜力。9[0007]非常年轻和适应性的成体干细胞(也称为新生干细胞)的广泛来源是脐带血或组织或胎盘。例如，大量干细胞可来源于脐带组织，即来自脐带基质_华通氏胶(Mitchell,K.E.等人，(2003)StemCells21,50_60；U.S.Patent5,919,702；US专利申请2004/[0008]IPS最早是由Takahashi和Yamanaka产生的，他们通过过表达四个转录因子OCT3/粒载体和用于p53抑制的p53_shRNA转移到人皮肤成纤维细胞和牙髓中，因此允许外源DNA斥的需要。这个范例已经在非人灵长类模型中用成纤维细胞和骨髓衍生的iPS得到证实列，在iPS细胞中发现的遗传和表观遗传突变随着供体年龄的增加而增加(LoSardo等人，[0013]本发明涉及产生如本文所述的诱导多能干(iPS)细胞的方法、所得诱导多能干细羊膜干细胞是脐带羊膜间充质干细胞或脐带所述方法获得的诱导多能干细胞群。诱导多能干细胞群可以是从脐带羊膜间充质干细胞括向受试者施用从通过本发明获得的多能干细胞分化[0021]本发明还涉及一种使如本文所述的诱导多能干(iPS)细胞分化为视网膜色素上皮的RPE细胞治疗受试者的视网膜退行性疾病的方法，以及包含通过如本文所述的方法获得述方法包括在适于分化为RPE细胞的条件下，在分化培养基中培养衍生自脐带羊膜的干细[0024]在本发明的第二方面，本发明提供一种通过所述方法可获得的RPE细胞培养物以[0025]在本发明的第三方面，本发明还提供一种由通过所述方法可获得的所述RPE细胞培养物组成或包含通过所述方法可获得的所述RPE细胞培养物的视网膜色素上皮，以及由通过所述方法获得的所述RPE细胞培养物组成或包含通过所述方法获得的所述RPE细胞培[0027]在本发明的第五方面，本发明还提供一种治疗受试者的视网膜退行性疾病的方[0028]在本发明的第六方面，本发明提供一种检测RPE细胞在受试者中的存活率的体内[0029]在本发明的第七方面，本发明提供了一种确定RPE细胞在受试者中的免疫原性的[0031]图1示出了示意性代表本发明的产生诱导多能干细胞的方法的示例性实施方案的实验步骤的流程图。本文所用的干细胞是从脐带羊膜分离的——也称为脐带衬干细胞编码Yamanaka因子的质粒添加至细胞_缓冲液混合物中。分别对脐带衬间质细胞(CLMC)和脐带衬上皮细胞(CLEC)用1个脉冲(脉冲的持续时间为约20ms且电压为约1600V)或用2个脉胞培养基的1:1混合物。同样大约每两天更换该培养基以保持培养基新鲜。当达到直径约CLiPS集落从涂布的培养装置上解离并转移至另一个适合于细胞培养和增殖的细胞培养容[0032]图2示出了单个CLSC群的重编程效率的示例性比较。干细胞已经经受了不同的电穿孔设置，以将外源核酸转染到细胞中。使用Okita等人(同上)中所示的电穿孔参数[0033]图3示出了来自人CLMC的诱导多能干细胞的示例性集落发育。图3a_f示出了集落发育的代表性时程，其中图3a描绘了在培养第0天在其维持培养基中培养的人CLMC的典型和3f示出了第一代iPS集落的典型形态的10x放大。图3g_l描绘了从人脐带衬细胞衍生的3g示出了KLF4的表达，图3h示出了NANOG的表达，图3i示出了OCT3/4的表达，图3j示出了天出现的放大20x的示例性人CLMSC_DTHN培养物。图3o示出了在层粘连蛋白_511基质(substrate)上培养的放大4x的扩增的人CLMSC_DTHN的示例性形态。图3p示出了在层粘连的CLMSC_DTHNiPS中的示例性表达。图3u示出了人多能标记物NTRA_1_81在处于第3代的后11天的亲代细胞(D11转染的细胞)和已建立的iPS克隆(CLiPS)中重编程基因表达和多能氢酶(GAPDH)用作内部对照。使用没有逆转录的智人(H1)总RNA的PCR来控制所有引物对的[0034]图4示出了CLiPS注射后免疫受损的非肥胖糖尿病重度联合免疫缺陷(NOD_SCID)(DAPI)显现的分化成肝细胞的CLiPS。图4h示出了用人血清白蛋白(HAS)、细胞角蛋白18(CK18)和DAPI显现的分化成肝细胞的CLiPS。图4i示出了用油红O显现的分化成肝细胞的(MLC2a)和DAPI显现的分化成心肌细胞的CLiPS。图4k示出了用底板(floor_plate)标记物示出了用神经元特异性III类β_微管蛋白(TUJI)和酪氨酸羟化酶(TH)显现的分化成多巴胺示出了用O4和DAPI显现的分化成少突细胞祖细胞的CLiPS。图4o示出了分化第45天成熟的[0036]图5显示了人CLiPS向各种不同细胞类型的示例性定向分化，其中图5a描绘了用TH、Tuik和DAPI显现的人CLiPS衍生的神经元，图5b描绘了用CK18、HAS和DAPI显现的人[0037]图6示出了在iPS和从它们分化的多巴胺能神经祖细胞上主要组织相容性复合体(MHC)I类和II类以及T细胞共刺激蛋白表达的示例性流式细胞术分析。图6a示出了未分化[0038]图7示出了从人CLiPS和人成体成纤维细胞_iPS(asF_iPS)衍生的多巴胺能神经元神经元存在于丰富的人NCAM阳性植入神经元中。图7a示出了从人asF_iPS衍生的第25天多图7d示出了用人CLEC_iPS衍生的多巴胺能NPC移植后1个月，在免疫活性C57BL/6NTac小鼠起沿着胼胝体的镊子主体(forcepsmajor)投射到脑的远端区域。图7f中的箭头指示人羟基多巴胺(6_OHDA)注射到C57BL/6NTac小鼠的纹状体中诱导PD损伤开始的实验步骤。在NPC移植前一周和两周进行移植前旋转行为测定。图8h示出了在移植了从人EC23_CLiPS和asF_iPS衍生的多巴胺能NPC的小鼠和假对照中阿扑吗啡诱导的旋转不对称性测定的结果。asF_iPS组相比显示了统计学上显著的旋转恢复(n＝5，p<0.05)。在假组中没有观察到恢asF_iPSNPC或假对照的小鼠相比，移植了人EC23_iPSNPC的小鼠显示了DAT活性的恢复。PE_P2I配体摄取，以评估iPS衍生的NPC移植后6个月纹状体多巴胺能神经元中多巴胺转运CLEC_iPS衍生的NPC的小鼠显示了D[0042]图11示出了在完全免疫活性的WistarHannover大鼠中建立的PD内侧前脑束(MFB)损伤模型中移植的人EC23_CLiPS多巴胺能NPC的组织学和功能分析结果。图11a示出了移植后3个月人EC23_CLiPS神经元在大鼠脑的纹状体区域的植入，这通过对人细胞质[0043]图12a、b和c各自示出了通过使用PTTe_3培养基作为回收培养基而产生的从人[0045]图14示出了CLMC具有始终高的分化效率：图14a示出了用于基于色素沉着细胞占示用不同深浅的棕色表示的不同等级的色素沉着的孔在板上的百分比。数字1_3代表生物出了使用ChemiDocTouch凝胶成像系统(Bio_RadLaboratories)在分化第30天在相同条板的图像分析得到的色素沉着暗度的图。图15d示出了在CLiPS中与色素沉着相关的和RPE[0047]图16示出了在分化第18天和第35天时表达RPE特异性基因的CLiPS：RPE特异性[0048]图17示出了CLiPS衍生的_RPE是功能性的。图17a示出了通过体外产生的RPE形成体外产生的RPE是高度吞噬的：FITC标记的光感受器外节(POS)被来自不同干细胞的RPE吞合分化培养物的所有细胞按照高散射(色素沉着的RPE细胞)和低散射(非色素沉着的非_法获得的RPE的产率。图20f示出了通过Pmel17流式细胞术评估的来自不同纯化方法的RPE光感受器外节(POS)吞噬测定评估的来自不同纯化方法的RPE的吞噬能力。图20i示出了比较不同RPE纯化方法的表。图20j示出了在CLMC23和H9中RPE特异性基因表达的定量PCR比[0052]图21示出了CLiPs_RPE(CLEC23_RPE)具有与天然RPE(AHRPE)相似的生物能图谱。(AHRPE–f)中所见类似，使得与其他分化的RPE相比，CLiPs_RPE细胞在功能上更接近原代能力在CLEC23_RPE暴露于H2O2(虚线曲线)后没有降低(g)vs.ASF5_RPE中有27％下降(h)和[0053]图22示出了免疫系统没有清除所有干细胞衍生的视网膜色素上皮(SC_RPE)细胞点，注射的包埋在基质胶栓中的表达萤光素酶的SC_RPE的体内生物发光测量(总辐射率)。[0054]图23示出了CLEC23_RPE组具有降低水平的参与细胞免疫应答诱导的促炎细胞因子。图23a和b示出了在分析终点时的血清细胞因子(IFN_γ和IL_18)。图23c示出了显示[0055]图24示出了CLEC23_RPE可抑制CD8T细胞活化。图24a和b示出了在分析终点的血清细胞因子(IL_23和IL_17A)。图24c示出了流式细胞术分析后计算T细胞(CD3)与B细胞[0056]本发明尤其涉及在适合于重编程干细胞的条件下从脐带羊膜干细胞产生诱导多[0057]在本发明中，脐带羊膜间充质和上皮干细胞—在此也统称为脐带衬干细胞胺能神经元(参见实施例7)和少突细胞(参见实施例1的情况下在小鼠帕金森病(PD)模型中存活达9个月，在没有免疫抑制的情况下在大鼠PD模多能干细胞可以潜在地用作人中同种异体细胞移植的细胞的通用来源，而不需要免疫抑在目前的良好生产实践(cGMP)条件下生产iPS。由于最近已经建立了用于生产大量脐带羊[0058]总之，来自非常年轻的组织的CLiPS由于来自年轻的组织，因此较不可能携带遗[0059]本发明人发现，通过本发明的方法，这种CLiPS稳健地分化为视网膜色素上皮充质(CLMC)或外胚层(CLEC)来源的。然后，本发明人比较了CLiPS与ES和皮肤_iPS细胞的RPE比ES衍生的RPE具有更高的色素沉着。由CLiPS产生的RPE在体外成熟后也显示RPE的功物能发现CLiPS_RPE比ES_衍生的RPE具有更高的糖酵解和线粒体呼吸。本发明的用于将源自脐带羊膜干细胞的诱导多能干(iPS)(CLiPS或[0060]现在首先描述本发明的产生iPS的方法，该方法可以包括表达编码蛋白OCT3/4、制因子p53来控制细胞周期的G1至G2转换。L_MYC(序列IDNo:7)编码激活增殖基因表达的转录因子(序列IDNo:8)。LIN28(序列IDNo:9)编码RNA结合蛋白Lin_28同系物A(序列IDp53是一种当蛋白在细胞中积累时可以通过终止它来调节细胞周期的蛋白。为了避免经由[0061]如上所述，本发明的诱导多能干细胞群可通过对脐带羊膜干细胞重编程而获脐带干细胞可以是脐带羊膜的(分离的)间充质干细胞，也称为脐带衬间充质干细胞专利申请2006/0078993(得到授权的美国专利9,085,755和9,737,568)或相应的国际专利美国专利申请2006/0078993(得到美国专利9,085,755和9,737,568)或相应的国际专利申[0063]也可以使用如公开的美国申请2018/127721或相应的国际申请WO2018/067071中所述的间充质干细胞群作为起始材料。国际申请WO2018/067071的间充质干细胞群的优点是该群的干细胞中99％或更多对三种间充质干细胞标记物CD73、CD90呈阳性，同时缺乏CD34、CD45和HLA_DR的表达，这意味着国际申请WO2018/067071的间充质干细胞群中99%DR。这种非常同质且明确定义的细胞群是临床试验和基于细胞的疗法的理想候选者，因为它们例如完全满足对于用于细胞疗法的人间充质干细胞普遍接受的标准，如Dominii等人“Minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.TheInternationalSocietyforCellularTherapypositionstatement”,Cytotherapy cellsaccordingtogoodmanufacturingpractices:a,review”,StemCellResearch&Therapy2013,4:66)、Vonk等人StemCellResearch&Therapy(2015)6:94或Kundrotas067071的间充质干细胞群是在GMP条件下生产本发明CLiPS的理想起始材料。能干细胞是通过将脐带羊膜干细胞(群)重编程为这样的诱导多能干细胞(群)的任何适合的方法可获得的。尽管产生这种诱导多能干细胞的一种方法包括在适合于重编程干细胞的条件下在脐带羊膜干细胞中表达编码蛋白OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28和L_MYC以及p53_“Transdifferentiationandreprogramming:Overviewoftheprocesses,their地进行，或通过在细胞内表达编码重编程因子的外源核酸生物地进行。或者，编码蛋白微小RNA(miRNA)。外源核酸可以原样转移，或者外源核酸可以掺入到适合于转移到细胞中于转移到干细胞中的载体提供。在一个说明性实例中，三种载体可以提供用于将CLSC重编程为CLiPS的外源核酸，其中所述载体可以是pCXLE_hOCT3/4_shp53_F(Addgene质粒#27077；序列IDNo:12)、pCXLE_hSK(Addgene质粒#27078，序列IDNo:13)和pCXLE_hUL 量的从CLMC衍生的CLiPS的电穿孔取决于转染的每种载体(质粒)DNA与用于转染的CLMC的量与细胞数的比率可以在1.5μgDNA比约1x106个CLMC至约2.5μgDNA比约1x106个CLMC的其显示了使用每种质粒的载体(质粒)DNA的量与细胞数的约1.67μgDNA比约1x106个CLMC取决于转染的每种质粒DNA的量与用于转染的CLEC的数量的比率。此比率在本文中也通过用于转染的载体(质粒)DNA的量(以μg计)比待转染的CLEC数(以1x106个细胞计)来表示。种载体的质粒DNA的量与细胞数的约1.67μgDNA比约1x106个CLEC的比率提供了有效的转同的量使用每种载体。CLEC和CLMC两者的电穿孔可以在本发明的方法中在均匀电场中进可以使用任何适合于细胞回收和/或增殖的细胞培养基。这种适合的细胞培养基的说明性TM持CLEC或CLMC增殖(无分化)/健康生长的任何培养基。用于CLEC的这种培养的合适培养基的实例例如描述于美国专利申请2006/0078993，并且包括EpiLife培养基、培养基171、的实例例如描述于美国专利申请2006/0078993和2018/127721以及国际专利申请WO2007/或PTT4(其中后者已经用于本文实施例部分来产生从CLMC衍生的CLiPS)的培养基。对于这种细胞回收培养，也可以使用这些培养基的混合物(例如mT[0070]例如，适合于回收经转染的CLMC的培养基可以由(化学)成分确定的培养基和FBSFBS。另一种这样的培养基可以包含终浓度为约20％(v/v)的乳腺上皮基础培养基MCDB混合以下以获得1000ml终体积的培养基来获得适合于回收经转染的CLEC[0078]在适合于回收经转染的CLEC的培养基中的生长因子可以是胰岛素样生长因子胰岛素。在一个实例中，在培养基PTTe_3中培养CLEC以在转染后回收细胞，其中培养基[0079]根据上文，适合于回收经转染的CLEC的培养基可以包含终浓度为约1ng/ml至约的氢化可的松和终浓度为约0.1ng/ml至约5ng/ml的3,3’,5_三碘_L_甲状腺原氨酸钠盐以包含来自霍乱弧菌(Vibriocholerae)的霍乱毒素(其可例如以目录号C8052从Sigma10M的终浓度存在。[0080]“DMEM”是指杜尔贝科改良伊格尔培养基，其在1969年开发，并且是基础培养基DMEM都可用于本发明。在优选的实施方案中，本文所用的DMEM是可以目录号12_604F从计为在与血清和激素和转铁蛋白组合使用时培养各种哺乳动物和杂交瘤细胞的营养混合物。任何可商购获得的哈姆F12培养基(例如，来自ThermoFisherScientific(目录号多不同哺乳动物细胞生长的基础培养基，可从诸如ThermoFisherScientific(目录号号M171500从LifeTechnologiesCorporation获得其可以粉末形式商购获得，例如以目录号M2162从美国Biological,SalemMassachusettsUSA或以目录号(MBS652676_10l)从荷兰Bio_ConnectB.V.,Hui[0084]EpiLife培养基是指HEPES和碳酸氢盐缓冲的液体培养基5％CO2和95％空气气氛的培养箱中使用。可以目录号MEPICF500从ThermoFisherScientific或以产品代码E0151从SigmaA清时尤其可用于克隆猴肾细胞和用于其它哺乳动物细胞系的生长。CMRL培养基可例如从ThermoFisherScientific(目录号1153衍生产品的安全性和安全使用。作为ISIA成员的FBS供应商包括AbattoirBasics[0087]适合于细胞回收的培养基也可以含有化合物，其可以抑制炎性反应和/或还可以的或无血清的。血清来源的涂层的实例可以是具有来自基底膜样基质诸如基质胶511E8片段、或层粘连蛋白521、玻连蛋白，例如以可商购获得的citronectinXFTM、后约2天进行培养基更换。用于培养基更换的另一种细胞培养基也可以是不同细胞培养基体积的适合于细胞回收的培养基与1个体积的第二细胞培养基接触来制备。在另一个优选1个体积的适合于细胞回收的培养基与2个体积的第二细胞培养基(或2个体积的适合于细二细胞培养基可以是任何适合于增强或维持iPS增殖的细胞培养基(这样的培养基在本文XF、TeSRTM_E8、mTeSRTMPlus、TeSRTM2或mTeSRTM1、corningNutristemBhPSCXFMedium、Essential8Medium(ThermoFisherScientific)、StemFlex(ThermoFisher因为迄今为止在cGMP合适条件下培养的CLMC衍生的CLiPS可以保持无动物和异种物质，由CLMC衍生的CLiPS集落可以例如被转移于用血清来源物质诸如基质胶(Matrigel)涂布的细[0092]当达到适合的汇合时，CLiPS集落或由集落形成的细胞群通常从经涂布的细胞培四乙酸(EDTA)的螯合剂的溶液或含有诸如胰蛋白酶或分散酶的酶的溶液(参见本申请的实除去细胞与细胞粘附的化学品都可以用于本发明上下文中的CLiPS传代，其中化学品的浓度可以适合于除去细胞与细胞粘附而不损害细胞。这种化学品的说明性实例可以是EDTA。明中，用于传代的细胞培养基可以补充了适合于增强CLiPS解离时的存活的物质。为此目的CLiPS在分化成靶细胞之前存活适合的时间段的物质的培养基生CLiPS的主细胞库，可以将通过本文所述方法获得的CLiPS细胞接种在培养容器诸如细胞E8、mTeSRTMPlus、TeSRTM2或mTeSRTM1、coring⃞Nutristem8hPSCXFMedium、Essential8Medium(ThermoFisherScientific)、StemFlex(ThermoFisherStemFitBasic02(AjinomotoCo.Inc)或PluriSTEM(MerckMillipore)。从CLMC衍生的任何适合的浓度接种CLiPS细胞(CLMC和CLEC衍生的CLiPS)以进行传代培养。传代培养可以通过在简单的培养瓶中培养来进行，也可以在例如多层系统中培养，所述多层系统诸如CellSTACK(Corning,NY,USA)或细胞工厂(Nunc,Thermo培养也可在封闭的自持式系统诸如生物反应器中进行。生物反应器的不同设计是本领域技术人员已知的，例如平行板、中空纤维或微流体生物反应器。参见，例如，Sensebe等人“Productionofmesenchymalstromal/stemcellsaccordingtoCellExpansionSystem(TerumoBCT,Inc)，其例如已用于临床试验的骨髓间充质干细胞的扩增(参见Hanley等人，EfficientManufacturingofTherapeuticMesenchymalStromalCellsUsingtheQuantumCellExpansionSystem,Cytotherapy.2014年8月；16(8):1048_1058)和国际专利申请WO2018/067071中所述的高纯度脐带衬间充质干细胞群的扩增。可用于本发明CLiPS群传代培养的可商购获得的生物反应器的另一个实例是可从GEHealthcare获得的XuriCellExpansionSystem。如果用于治疗应用的工作细胞库将在GMP条件下生产并且需要高数量的细胞，则CLiPS群在自动化系统诸如Quantum&CellExpansionSystem中的培养是特别有益的。对于传代培养，CLiPS也可培养至合适量[0095]本发明还涉及通过本文所述方法可获得的CLiPS和通过本文所述方法获得的明还涉及包含通过本文所述方法可获得/获得的iPS的药[0096]本发明进一步涉及在适合于分化的条件下使CLiPS分化成靶细胞的方法。适合的用于使iPS分化成期望的靶细胞的已知方案中获得(在这方面参见Hirschi等人“InducedPluripotentStemCellsforRegenerativeMedicine”充了糖原合酶激酶3抑制剂诸如CHIR99021的无蛋白质、脂质和生长因子的培养基。RPMI/2％_B27减去胰岛素可以是用于CLiPS分化成肝细胞的合适培养基的实例。实施例9中示例生长因子的培养基将CLiPS分化成少突细胞，所述培养基允许分化成配对的框6阳性(PAX6其神经衍生物的免疫原性的分析显示免疫原性降低(实CLiPS衍生的多巴胺能神经元显示功能性移植和甚至多巴胺再摄取功能的显著恢复(参见如Shi等人“Inducedpluripotentstemce碍可以是神经障碍，诸如例如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化硬化和病毒性肝炎。先天性或获得性退行性障碍也可以是心脏障碍，尤其包括急性Danon细胞衰老、增殖和分化、组织内稳态、组织修复和再生Pegtel,D.M.和S.J.Gould,Exosomes.AnnuRevBiochem,2019.88:p.487_514或Kalluri,R.和V.S.LeBleu,Thebiology,function,andbiomedicalapplicationsofexosomes.Science,2020.367(6478)。外泌体参与了广泛的疾病，包括癌症(参见例如Visan,K.S.,R.J.Lobb,和A.Moller,Theroleepithelial_to_mesenchymaltransitionandmetastasis.FrontBiosci(LandmarkEd),2020.25:p.1022_1057，或Zhang,L.和D.Yu,Exosomesincancermetastasis,andimmunity.BiochimBiophysActaRevCancer,2019.1871(2):p.455_468)、骨关节炎(Asghar,S.等人，Exosomesinintercellularcommunicationand化(ALS)(参见例如Liu,W.等人，RoleofExosomesinCentralNervousSystemDiseases.FrontMolNeurosci,2019.12:p.240或Quek,C.和A.F.Hill,Theroleofextracellularvesiclesinneurodegenerativediseases.BiochemBiophysResexosomesinmentaldisorders.TranslPsychiatry,2019.9(1):p.12(Wang,Y.等人，Exosomes:Anemergingfactorinatherosclerosis.Biomedandexosomesinmetabolicdiseasesandinflammation.CytokineGrowthFactorRev,2020.51:p.27_39或Soazig,L.L.,A.Ramaroson,和M.M.Carmen,Exosomesinmetabolicsyndrome,inExosomes:AClinicalCompendium,L.R.Edelstein等人，Editors.2020,AcademicPress.p.343–356)和和脐带)分离的间充质干细胞(MSC)已经表现为特别有利。MSC衍生的外泌体在角膜、心血性细胞外，体外培养的多能干细胞(PSC)诸如胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPS)已显示产生外泌体(Song,Y.H.等人，ExosomesDerivedfromEmbryonicStemCellsasPotentialTreatmentforCardiovascularDiseases.AdvExpMedBiol,2017.998:p.187_206，或Jeske,R.等人，HumanPluripotentStemCell_DerivedExtracellularVesicles:CharacteristicsandApplications.TissueEngPartBRev,2020.26(2):Vesicles:ExtendedMessagesofRegeneration.AnnuRevPharmacolToxicol,体外培养物免于缺氧和外泌体生物起源抑制(Liu,B.等人，Cardiacrecoveryviaextendedcell_freedeliveryofextracellularvesiclessecretedbycardiomyocytesderivedfrominducedpluripotentstemcells.NatBiomedEng,的外泌体在体外划痕测定中加速人皮肤成纤维细胞和人角质细胞的增殖，并增强伤口愈SecretedfromInducedPluripotentStemCell_DerivedMesenchymalStemCellsAccelerateSkinCellProliferation.IntJMolS生物产生的细胞外膜囊泡或外泌体被认为可用于治疗疾病，包括上述示例性疾病诸如癌A.Marazioti,ExosomesandExosome_InspiredVesiclesforTargetedDrugendogenousnanomaterialsforadvanceddrugdeliveryandtherapy.ActaBiomater,2019.86:p.1_14或Wang,X.等人，Cell_derivedExosomesasPromisingCarriersforDrugDeliveryandTargetedTherapy.CurrCancerDrugTargets,化衍生物产生的细胞外膜囊泡或外泌体也被考虑可以作为用于促进治疗剂的细胞摄取的[0103]由CLiPS(从CLMC或CLEC衍生的)或CLiPS的分化衍生物产生的细胞外膜囊泡和外[0104]本发明进一步涉及一种使iPS细胞分化成RPE细胞的特定方法，所述iPS细胞衍生的CLiPS是CLEC23。通过本文所述的分化方法由本文定义的CLiPS分化的RPE细胞可以指胞的分化与源自ES细胞(比如H9ES细胞)的RPE细胞(当提及这样的RPE细胞时也称为ES衍生的RPE)的分化和/或与源自皮肤衍生的iPS细胞(也称为皮肤iPS；因此当提及这样的RPE[0106]在包括培养衍生自脐带羊膜干细胞的iPS细胞的使iPS细胞分化成RPE细胞的分化方法中使用的分化培养基优选地是本文定义的包含N2补充、B27补充和非必需氨基酸N2补充物、1×B27补充物和1×NEAA意指最终浓度为1x，这也可以在下文的实施方案中看[0111]如本文定义的分化培养基可以进一步包含/补充有如本文其它地方定义的各种生过使用根据本发明的使iPS细胞分化为RPE细胞的方法使所述细胞分化为[0112]特别地，用于培养iPS细胞以使所述细胞分化成RPE细胞的本发明的使iPS细胞分化成RPE细胞的方法中使用的分化培养基可以包含第一分化培养基，其另外包含IGF1、[0113]此外，用于培养iPS细胞以使所述细胞分化成RPE细胞的本发明的使iPS细胞分化成RPE细胞的方法中使用的分化培养基可以另外或可选地包含第二分化培养基，其另外包述基础培养基，所述基础培养基包含DMEM培养基，优选包含含有N2补充物、B27补充物和NEAA的DMEM/F12培养基，甚至更优选包含含有1×N2补充物、1×B27补充物和1×NEAA的DMEM/F12培养基。在优选的实施方案中，如本文所定义的第二分化培养基另外包含IGF1、[0114]此外，用于培养iPS细胞以使所述细胞分化成RPE细胞的本发明的使iPS细胞分化成RPE细胞的方法中使用的分化培养基可以另外地或可选地包含第三分化培养基，其另外NEAA的DMEM/F12培养基，甚至更优选包含含有1×N2补充物、1×B27补充物和1×NEAA的DMEM/F12培养基。在一个优选的实施方案中，如本文所定义的第三分化培养基另外包含[0115]此外，用于培养iPS细胞以使所述细胞分化成RPE细胞的本发明的使iPS细胞分化成RPE细胞的方法中使用的分化培养基可以另外地或可选地包含第四分化培养基，其另外[0116]此外，用于培养iPS细胞以使所述细胞分化成RPE细胞的本发明的使iPS细胞分化成RPE细胞的方法中使用的分化培养基可以另外地或可选地包含第五分化培养基，其另外xN2补充物、1xB27补充物和1xNEAA的DMEM/F12培养基。在优选的实施方案中，如本文定义的第五分化培养基另外包含激活素A、CHIR99021和PD17307(出于与上文定义相同的原渐增加防止了当使用高浓度CHIR时由其引起的过度细胞死亡。这提高了色素沉着RPE细胞的产率。当随后应用第五分化培养基时，其优选包含激活素A、SU5402或PD17307，优选在约5ng/ml至约15ng/ml、约6ng/ml至约14ng/ml、约7ng/ml至约13ng/ml、约8ng/ml至约包括在本文其它地方定义的分化培养基中培养所述iPS细胞，其中IGF1在本文定义的所述甚至更优选以约10ng/ml的终浓度使用约2(个方定义的分化培养基中培养所述iPS细胞，其中DKK1在本文定义的所述分化培养基中应用约10ng/ml的终浓度使用约2(个连续)日。当将DKK1用在如本文定义的第三分化培养基中时，DKK1使用约2天，优选约2个连续日(这意指培养的第4天至第6天)，甚至更优选以约10ng/ml的终浓度使用约2(个连续至少约8mM、至少约9mM或至少约10mM；或在约5mM至约15mM、约6mM至约14mM、约7mM至约法包括在如本文其它地方定义的分化培养基中培养所述iPS细胞，其中烟酰胺在如本文定的第一分化培养基中时，烟酰胺使用约2天，优选约2个连续日(这意指培养的第0天至第2二分化培养基中时，烟酰胺使用约2天，优选连续约2个连续日(这意指培养的第2天至第4的终浓度用在如本文其它地方定义的分化培养基中。在另一个优选的实施方案中，LDN_193189以约0.2μM的终浓度用在如本文其它地方定义的分化培养基中。在甚至包括在如本文其它地方定义的分化培养基中培养所述iPS细胞，其中LDN_193189在如本文至更优选约4个连续日、最优选以如本文别处定义的至少约0.至少约5ng/ml；或在约2.5ng/ml至约7.5ng/ml、约3ng/ml至约7ng/ml、约3.5ng/ml至约RPE细胞的方法，所述方法包括在如本文其它地方定义的分化培养基中培养所述iPS细胞，[0122]当将激活素A应用在如本文其它地方定义的分化培养基中时，使用至少约50ng/90ng/ml或至少约100ng/ml；或在约50ng/ml至约150ng/ml、约60ng/ml至约140ng/ml、约ml至约140ng/ml、约70ng/ml至约130ng/ml、约80ng/ml至约120ng/ml、约90ng/ml至约ml至约150ng/ml、约60ng/ml至约140ng/ml、约70ng/ml至约130ng/ml、约80ng/ml至约约8天、至少约10天、至少约12天、优选约12天、甚至更优选约12个连续日、最优选以约100ng/ml的终浓度使用约12(个连续)日。当将激活素A应用在如本文所定义的第三分化培选以约100ng/ml的终浓度使用约2(个连续)天/日。当将激活素A用在如本文定义的第四分更优选以约100ng/ml的终浓度使用约2(个连续)天/日。当将激活素A用在如本文定义的第甚至更优选以约100ng/ml的终浓度使用约8(个连续)天在如本文其它地方定义的分化培养基中培养所述iPS细胞，其中将SU5402在如本文其它地度使用约10(个连续)天/日。当将SU5402应用在如本文所定义的第四分化培养基中时，约1μM的终浓度用在如本文其它地方定义的第四分化培养基。在另一个甚至更优选的实施于培养细胞达约3个连续培养日，所述细胞即分化为或已经分化成RPE细胞的本发明iPS细以约1μM且小于约1.5μM的终浓度用在本文其它地方定义的第五分化培养基中使用的最终分化为或已经分化成RPE细胞的本发明iPS细胞，最优选以约1.5μM的终地方定义的第五分化培养基中，以用于培养细胞达约3个连续培养日(意指培养的第8天至3μM的终浓度用于随后培养细胞，所述细胞即分化为或已经分化成RPE细胞的本发明iPS细[0128]本发明进一步包括分化成RPE细胞的方法，所述方法包括在如本文其它地方定义[0129]在最优选的实施方案中，分化培养基包括第一分化培养基，其包含约1μMLDN_素A。在另一个最优选的实施方案中，所述分化培养基包括第四分化培养基，其包含约mL激活素A、约10μMSU5402和约3μMCHIR99021，优选地包含约100ng/mL激活素A、约1μM它地方所定义的第一分化培养基中培养约2天，优选在如本文其它地方所定义的第一分化文其它地方所定义的第二分化培养基中培养约2天，优选地其包括在如本文其它地方所定义的第一分化培养基中培养约2天，随后在如本文其它地方所定义的第二分化培养基中培至更优选地其包括在如本文其它地方所定义的第一分化培养基中培养iPS细胞约2个连续后在如本文其它地方所定义的第四分化培养基中培养约2天，甚至更优选地其包括在如本所定义的第二分化培养基中培养约2个连续日，随后在如本文其它地方所定义的第三分化文其它地方定义的第五分化培养基中培养约8天，优选地其包括在如本文其它地方定义的第一分化培养基中培养约2天，随后在如本文其它地方定义的第二分化培养基中培养约2义的第四分化培养基中培养约2天，并随后在如本文其它地方定义的第五分化培养基中培地方定义的第三分化培养基中培养约2个连续日，随后在如本文其它地方定义的第四分化培养基中培养约2个连续日，并随后在如本文其它地方定义的第五分化培养约8个连续日。括在如本文其它地方所定义的包含如本文其它地方所定义的以至少约1μM且小于约3μM的浓度使用的CHIR99021的第五分化培养基中培养约4天，随后在包含以约3μM的浓度使用的少约1μM且小于约3μM的浓度使用的CHIR99021，随后在第11天将细胞从第11天至第16天暴包括在在如本文定义的分化培养基中培养iPS细胞之前，在mTESR1培养基中培养iPS细胞。CLiPs和作为参照细胞系的人ES细胞可以在mTeSR1培养基中在基质胶(Matrigel)涂布的组选在在如本文定义的第一分化培养基中培养iPS细胞之前，最优选在在如本文定义的第一的实施方案中，本发明的分化方法的所述RPEM培养基还包含热灭活的胎牛血清(FBS)、活的胎牛血清(FBS)、1×Glutamax、约0.25mg/mL牛磺酸、约0.02μg/mL氢化可的松、约[0139]本发明还包括如本文其他地方所定义的所述分化方法，其中将RPE细胞在如本文地方所定义的分化培养基中培养iPS细胞约16天和具有在如本文其他地方所定义的RPEM培化板可以仅具有纯的RPE细胞(图20)。分化方法的额外纯化步骤优选包括a)根据其色素沉着手动识别RPE细胞，其中根据其色素沉着手动识别RPE细胞优选包括通过显微镜检查选择，更优选通过本领域技术人员已知的明场显微镜选择。该步骤可以指RPE细胞的手动纯所有非RPE细胞。另外或可选地，所述分化方法的额外纯化步骤优选包括b)使RPE细胞传于培养板。然后其可以进一步包括再次用温和的解离剂诸如Accutase或TrypLE，优选用地，分化方法的额外纯化步骤优选包括c)如本文其他地方定义根据色素沉着手动识别RPETrypLE，优选地用TrypLE进一步处理所述剩余的RPE细胞，并且在散射分选中进一步处理e)根据RPE细胞的色素沉着对RPE细胞进行散射分选的组合。该步骤可以指RPE细胞的散射解离剂诸如Accutase或TrypLE，优选TrypLE解离)的细胞团块重悬于任何FACS缓冲液中并使其通过过滤器以获得单细胞并使用例如技术人员已知的任何FACS细胞分选仪将其分成[0142]通过比较如本文定义的不同RPE纯化方法，发现如上定义的包括用Accutase或细胞的手动纯化相比更容易且更快，因此其是优选的。如上定义的包括用Accutase或胞(约99％PMEL17阳性细胞)，这对于移植可能是最重要的。此外，如上定义的包括用TrypLE处理RPE细胞的使RPE细胞传代并结合手动识别RPE细胞的纯化涉及额外的手动纯化步骤以移除可能逃脱温和解离剂如Accutase或TrypLE，优选TrypLE处理的任何非_RPE细胞并用在分化成RPE细胞的方法中的iPS细胞具体通过在适于重编程如本文其它地方所定后根据所述分化方法分化成RPE细胞)的方法的每个公开内容，在必要时也适用于将iPS细[0144]本发明还涉及一种通过如本文所述的分化方法可获得的RPE细胞培养物/RPE细及一种视网膜色素上皮，其由通过本文所述的分化方法可获得/获得的视网膜色素上皮细胞培养物/RPE细胞组成或包含通过本文所述的分化方法可获得/获得的视网膜色素上皮细[0145]本发明还涉及一种药物组合物，其包含通过本文所述的分化方法可获得/获得的RPE细胞培养物/RPE细胞。包含分化的RPE细胞/含有分化的RPE细胞的RPE细胞培养物的药物组合物的实例是注射溶液或任何类型的适于植入分化的RPE细胞的移植物。当药物组合如本文定义的所述基质上生长的RPE细胞可以指通过如本文描述的分化方法可获得的/获的皮肤iPS细胞(例如Asf5、AGO和/或HDFA)的仅30％相比，通过本发明测试的所有四种含在所述培养物中的所述分化的RPE细胞可以表达BEST1、PMEL17、MITF、TYROSINASE、中，另外包含在所述培养物中的所述分化的RPE细胞可以表达蛋白标记物MERTK。因此，CLiPS衍生的RPE细胞与ES衍生的RPE细胞(如本文使用的H9细胞)相比更高度色素沉着。这此外，另外包含在所述培养物中的所述分化的RPE细胞的特征在于缺乏或具有降低的细胞[0147]更详细地，通过如本文所定义的方法可获得/获得的R相对于从胚胎干细胞(ES)(产生其的细胞或培养物)分化的RPE细胞，以至少约2、至少约定义的方法可获得/获得的RPE细胞可被进一步表征为，相对于从ES(产生其的细胞或培养示为测试细胞相对于参照细胞的倍数变化的基因表达[0149]还发现与从ES(产生其的细胞或培养物)分化的RPE细胞和/或从皮肤iPS(产生其TEER)。与从ES(产生其的细胞或培养物)分化的RPE细胞和/或从皮肤iPS(产生其的细胞或和/或线粒体呼吸增加。通过ECAR定量糖酵解或相对于从皮肤iPS分化的RPE细胞，RPE细胞的基础呼吸增加约38ii)相对于从ES分化的RPE细胞和/或相对于从皮肤iPS分化的RPE细胞，RPE细胞的ATP生产增加约40iii)相对于从ES分化的RPE细胞和/或相对于从皮肤iPS分化的RPE细胞，RPE细胞的最大能力增加约35iv)相对于从ES分化的RPE细胞和/或相对于从皮肤iPS分化的RPE细胞，RPE细胞的分化的RPE细胞和/或相对于从皮肤iPS分化的RPE细iii)相对于从ES分化的RPE细胞和/或相对于从皮肤iPS分化的RPE细胞，RPE细胞的糖酵解步被表征为，相对于从ES(产生其的细胞或培养物)分化的RPE细胞和/或相对于从皮肤iPS其获得包含所述RPE细胞的样品用于所述细胞的进一步分析的受试者，所述降低的全身性免疫应答可以指(a)参与诱导细胞免疫应答的促炎细胞因子，优选IFN_γ细胞免疫应答的指示物(surrogate))和/或IL_23和/或IL17A，参与T细胞活化的细胞因子别是由存在于所述受试者中并且也包含在所述样品中的所述免疫细胞产生。所述RPE细胞化的RPE细胞和/或相对于从皮肤iPS分化的RPE细胞具有降低的全身性T细胞活化，优选地在此上下文中，治疗可以包括向如本文定义的受试者施用通过如本文描述的分化方法从CLiPS分化的RPE细胞和/或通过本发明的方法获得的所述RPE细胞培养物和/或如本文定义且具有降低的细胞免疫应答，优选在将所述分化的RPE细胞预注射到本文定义的受试者中的参照受试者中获得的样品和/或相对于从之前已被预递送了从皮肤iPS分化的RPE细胞的参照受试者中获得的样品，从在细胞因子分析之前已预递送了所述分化的RPE细胞的受试网膜疾病，优选地，所述视网膜退行性疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)或视网膜营养不用所述从CLiPS分化的RPE细胞可以包括如技术人员已知的肠胃外或局部(优选视网膜下)应用。过如本文其它地方所定义的分化方法iPS细胞分化得到，所述方法包括a)将通过如本文所[0158]根据本发明分化的并在体内方法中如本文所定义被引入所述受试者的RPE细胞包明分化的并且在体内方法中如本文所定义的被引入所述受试者中的所述RPE细胞包含编码方案中，根据本发明分化的并在体内方法中如本文所定义被引入所述受试者的所述RPE细内方法的步骤a)还包括将通过如本文定义的方法分化的所述RPE细胞引入受试者，其中所述RPE细胞包含在如本领域技术人员已知的RPE_基质胶栓中。包含在基质胶栓中是指本领域技术人员已知的所述RPE细胞与基质胶的混合物[0159]如本文所定义的体内方法还包括步骤b)使用成像方法检测所述RPE细胞随时间的“监测”)指使用任何已知的成像方法对所述RPE细胞的生物发光进行体内可视化和定性分中以规律的间隔监测。生物发光的检测可以指本领域技术人员已知的以P/s/cm2/sr表示的的从ES细胞(优选H9细胞)分化和/或从皮肤iPS(优选HDFA或ASF5)分化的RPE细胞的生物发从皮肤iPS分化的所述RPE细胞也如CLiPS衍生的RPE细胞那样包含如本文所定义的生物发生物发光信号无差异指示所述RPE细胞在所述受试者中存活。无差异还包括与从ES细胞分化和/或从皮肤iPS分化的所述RPE细胞的参照成像数据相比，成像数据的生物发光信号随[0163]本发明还包括包含通过如本文其他地方所定义的分化方法获得/可获得的所述[0164]特别设想将通过体内分化方法由iPS细胞分化的所述RPE细胞向如本文定义的所述受试者中的引入，以及随后从所述受试者获得的包含所述RPE细胞的样品的体外分析用于在用于研究和开发目的各种模型中的此类细所述RPE细胞通过如本文所定义的方法从iPS细胞分化得到，所述分化的RPE细胞已经被预的样品中的促炎细胞因子水平，其中所述样品包含所述分化的RPE细胞，从而收集成像数[0167]在体外方法的步骤a)中从所述定义的受试者获得的样品可以是从所述受试者获[0168]体外方法可以包括检测从如本文定义的所述受试者获得的样品中的免疫细胞浸[0169]该方法进一步包括步骤b)将在步骤a)中接收的和/或从关于浸润的检测步骤接收ES细胞分化和/或从皮肤iPS分化的、作为参照细胞的RPE细胞的受试者的样品中如本文定义的相同检测的促炎细胞因子水平的成像数据，和/或所述参照成像数据是指在来自预先递送了从ES细胞分化和/或从皮肤iPS分化的、作为参照细胞的RPE细胞的受试者的样品中浸润并检测到相同免疫细胞的成像数据。所述参照细胞也可包含在与包含RPE细胞的样品像数据的细胞因子水平降低和/或免疫细胞浸润/累积降低/下降指示与从ES细胞分化和/或从皮肤iPS分化的RPE细胞的免疫原性相比，所述RPE细胞在所述受试者中的免疫原性降[0173]发现根据Okita等人(同上)所述方案的电穿孔根本不起作用。当按照Okita等人(同上)的方案用附加型载体pCXLE_hOCT3/4_shp53_F、pCXLE_hSK和pCXLE_hUL电穿孔CLMC孔设置，所述样品分别在本文所述的细胞特异性条件下培养。在每次电穿孔后，将约106个细胞的数目使用三种载体(pCXLE_hOCT3/4_shp5用于CLEC的电穿孔设置将对于CLEC42的电穿孔效率提高了约23.35将对于CLEC44的电数的1.67μg(质粒)DNA比约1×106个CLMC的比率成功转染了四个单独的CLMC系(CLMC42、(2011),pp.62–66，他们研究了人胚胎干细胞(hESC)衍生的间充质干细胞的电细胞中转染总共4μg(质粒)DNA提供了MSC转染的最佳条件。因此，本发明提供了分别用于[0180]新加坡CellResearchCorporationPteLtd分离并供应脐带衬上皮细胞(CLEC)自健康的78岁男性亚洲供体的成人皮肤成纤维细胞购自CellResearchCorporationPte[0183]使用实施例1中建立的条件进行体细胞重编程，并且进一步以不依赖于饲养者的有附加型载体pCXLE_hOCT3/4_shp53_F、pCXLE_hSK和pCXLE_hUL(分别为Addgene质粒#即将细胞转移到6ml含有1μM氢化可的松(StemCellTechnologies)的CLEC或CLMC培养基孔中的细胞达到～50％汇合时，用分散酶(StemCellTechnologies)将它们解离并转移到外，其它商业ES/iPS培养基诸如StermMACSTMiPS_BrewXF(MiltenyiBiotec)和TeSR_E8(StemCellTechnologies)已经用于维持iPS瓶中在其维持培养基PTTe_3和PTT_4中培养的活跃分裂CLEC或[0187]3.将细胞沉淀重悬于120μL缓冲液R(NeonTMTransfectionSystem100μLKit,ThermoFisherScientificMPK10096)中。加入含有pCXLE_hUL、pCXLE_hSK和pCXLE_[0188]4.将细胞悬浮液装入100μLNeon@Tip中。对于CELC使用以下参数进行电穿孔：[0189]5.立即将细胞转移到4ml含有1μM氢化可的松的CLEC或CLMC培养基(分别为PTTe_3[0190]6.电穿孔后两天，将培养基更换为CLEC或CLMC培养基Technologies)将它们解离并转移到基质胶涂布扩增的CLiPS表现出与成人皮肤成纤维细胞衍生的iPS或人胚胎干细胞(ES)的细胞形态学067071中描述的方案从命名为CLMSC_DTHN的cGMP级CLMC系产生iPS，用于产生间充质干细胶(Matrigel)(一种由Engelbreth_Holm_Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞制备的细胞外基质)被持的mTeSR1被cGMPmTeSRTM1(StemCellTechnolog[0201]在本文所述的条件下，CLMSC_DTHN以与CLMC相当的动力学和效率重编程(数据未[0203]当培养物达到～90％汇合时，进行CLiPS的传代培养(再次使用适合于维持iPS细份试样时达到细胞汇合的所需速率。然后将冷冻管转移至缓慢冷冻装置诸如Mr.FrostyTMFreezingContainer(ThermoScientific)或coolcelleCellFreezing不建议将CLiPS等分试样在_80℃下放置超过24小时。几种商业冷冻培养基诸如mFreSrTM(StemCellTechnologies)和cryostorCS10(BiolifeSolutions)也可用于低温保存，并可根据生产商的说明书使用。[0206]CLiPS功能性通过在电穿孔后将集落发育CLiPS进行免疫荧光染色来测定。由此，然后与适当的荧光染料偶联的第二抗体在室温下一起孵育2小时。将染色的样品在具有DAPI的ProLongDiamondAntifadeMountant(ThermoFisherScienti[0207]此外，通过进行核型分析和G条带分析来评估单个CLiPS系中染色体的数目和结转染的细胞)和CLiPS中重编程和多能基因的表达。为此目的，使用RNeasyMini或PlusMini试剂盒(Qiagen)从细胞沉淀分离总RNA。用DNaseI处理2μg的总RNA，并用于使用RevertAidHMinusFirstStrandcDNASynthesisKit(Fermentas，ThermoFisherScientific)的cDNA合成。PCR反应如下设置：0.5μlcDNA，5μl2xMyTaqHSMix(Bioline)，0.2μl正向引物(10μM)，0.2μl反向引物(10μM)[0209]通过琼脂糖凝胶分析进入SYBR安全DNA染色剂(ThermoFisherScientific)的2％琼脂糖凝胶上，并在80V电泳30