CN119506177A 一种利用异源丙氨酰化酶高效制备美登醇的方法 （山东大学）

一种利用异源丙氨酰化酶高效制备美登醇本发明涉及一种利用异源丙氨酰化酶高效所述基因工程菌HGFS10中异源表达D一丙氨酰化环氧化酶基因asm11及酰胺N一甲基化酶基因基4,5去环氧美登醇的体外催化效率是其同源蛋白AstC的8倍，为实现美登醇的生物制造提供2环氧化酶基因asm11及酰胺N_甲基化酶基因a所述D_丙氨酰化酶来源于链霉菌MMG1121，编码基因为smastC，核苷酸序列如SEQID2.如权利要求1所述的基因工程菌HGFS10，其特征在(2)将正调控因子基因asm18序列通过Gibson拼接的方式插入整合型载体pSV1的强启(3)人工合成如SEQIDNO.1所示的D_丙氨酰化酶基因smastC，然后连接至质粒载体(4)以珍贵橙色束丝放线菌突变株HGF052基因组为模板进行PCR扩增，得到C_4/5环氧(5)将C_4/5环氧化酶基因asm11和酰胺N_甲基化酶基因asm10分别连接至质粒载体pSET5035中，使得基因asm11和基因asm10位于kasop*启动子的下游，得到质粒载体pSET5035_kasOp*_asm11和pSET5035_kasOp*_asm10；然后将质粒载体pSET5035_kasOp*_体pSET5035_kasOp*_smastC_kasOp*_asm11_kasO(6)通过接合转移将过质粒载体pSET5035_kasOp*_smastC_kasOp*_asm11_kasOp*_5.一种利用权利要求1～3任一项基因工程菌HGFS101)将基因工程菌HGFS10在YMG琼脂培养基上划线活化，于28～30℃下培养3～5天至长32)将固体培养物切成1cm3的小方块，在20～30℃下用体积比为4:1的乙酸乙酯/甲醇浸3)将发酵粗提物溶解在甲醇中，通过中压液相6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所10.本发明提供一种利用权利要求5～9所述方法制备得到的美登醇，其化学结构如下4T_DM1)于2013年被美国FDA批准用于人表皮生长因子受体2(HER2)阳性晚期乳腺癌的治疗，年，另一款以美登木素衍生物为“弹头”的ADC药物mirvetuximabsoravtansine_gynx物发酵的方式获得结构类似物安丝菌素，随后通过化学法去除C_3位羟基所连的酰基基团为ADC药物。安丝菌素可由橙色束丝放线菌产生，其生物合成途径在本世纪初已被详细解安丝菌素产生菌珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnemapretiosumssp.auranticumATCC31565)抑或是其asm19基因敲除突变株HGF052，美登醇都只是以分支产物微量存在而非主[0005]中国专利文献CN111635418A一种美登木素衍生物及其合成方法和应用公开了包含丙氨酰化酶基因astC的整合型表达载体pSBT11_astC，并实现了丙氨酰化酶基因在珍贵CN114875095A一种丙氨酰美登醇及其合成方法和应用公开了通过替换AstC的TE结构域获得的丙氨酰美登醇由于产物构型难以确定以及产量极低的问题，很难作为ADC药物靶头的5[0006]在珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnemapretiosumssp.auranticumATCC环氧美登醇高效3一O一D一丙氨酰化的SmAstC酶；随后通过在HGF052中过表达正调控基因负责后续修饰的asm11和asm10基因在HGFS04中过表达构建出了美登醇产生基因工程菌发明中的方法将有效避免传统的美登醇制备过程中步骤冗杂且有不易消除的副产物等问[0009]第一方面，本发明提供一株利用异源丙氨酰化酶高效制备美登醇的基因工程菌过表达C4/5环氧化酶基因asm11及酰胺N甲基化酶基因asm基因asm10能够提高关键酶的协同催化能力，进而使得基因工程菌HGFS10实现了美登醇的[0018](2)将正调控因子基因asm18序列通过Gibson拼接的方式插入整合型载体pSV1的6体pSET5035中，使得基因smastC位于kasop*启动子的下游，得到质粒载体pSET5035_[0020](4)以珍贵橙色束丝放线菌突变株HGF052基因组为模板进行PCR扩增，得到C_4/5[0025](5)将C_4/5环氧化酶基因asm11和酰胺N_甲基化酶基因asm10分别连接至质粒载体pSET5035中，使得基因asm11和基因asm10位于kasop*启动子的下游，得到质粒载体pSET5035_kasOp*_asm11和pSET5035_kasOp*_asm10；然后将质粒载体pSET5035_kasOp*_体pSET5035_kasOp*_smastC_kasOp*_asm11_kasO[0026](6)通过接合转移将质粒载体pSET5035_kasOp*_smastC_kasOp*_asm11_kasOp*_[0028]1)将基因工程菌HGFS10在YMG琼脂培养基上划线活化，于28～30℃下培养3～5天7登醇的不稳定3OD丙氨酰化修饰的D丙氨酰化酶SmAstC，该酶对N去甲基4,5去环氧美登醇的体外催化效率是其同源蛋白AstC的8倍，为实现美登醇的生物制造提供了良好的8[0053](1)将生长在卡那霉素抗性平板的重组大肠杆菌单克隆挑取到抗性LB液体培养基[0055](3)将重组大肠杆菌菌体离心收集后以重悬缓冲液重悬，机械破碎后12000rpm离2[0057]将酶活体系在30℃下孵育3小时后以等体积甲醇终止，离心后进行HPLC和高分辨5去环氧美登醇有最佳催化活性的蛋白，其体外活性为AstC的8倍。所述D丙氨酰化酶9[0067](2)回收PCR产物，将回收的正调控因子基因asm18基因片段通过Gibson拼接的方式与经NdeI/XbaI酶切的整合型载体pSV1进行组装，插入至整合型载体pSV1的强启动子[0069](3)将质粒载体pSV1_asm18转化至DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的抗移转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002感受态细胞中，并通过接合转移转入珍贵橙色束丝放随后于30℃倒置培养5～7天后，挑取橙黄色接合子于含硫链丝菌素的抗性YMG平板上进行[0073](1)按照实施例1所述的方法获得质粒载体pET28a_smastC，然后以为质粒载体pET28a_smastC模板进行PCR扩增，得到D_丙氨酰化酶基因smastC基因片段，PCR引物序列[0076](2)以珍贵橙色束丝放线菌突变株HGF052基因组为模板进行PCR扩增，得到C_4/5酰胺N_甲基化酶基因asm10片段分别通过Gibson拼接的方式与经NdeI/XbaI酶切的[0084](3)将质粒载体pSET5035_kasOp*_smastC、pSET5035_kasOp*_asm11和pSET5035_[0085](4)以PstI/XbaI酶切质粒载体pSET5035_kasOp*_smastC获得kasOp*_smastC片段，以PstI/XbaI酶切质粒载体pSET5035_kasOp*_asm11获得kasOp*_asm11片段，以SpeI/EcoRI酶切质粒载体pSET5035_kasOp*_asm11获得kasOp*_asm10片段，以PstI/EcoRI酶切段通过T4连接酶连接至质粒载体pSET5035中，得到整合质粒载体pSET5035_kasOp*_smastC_kasOp*_asm11_kasOp*_asm10；然后将整合质粒载体pSET5035_kasOp*_smastC_kasOp*_asm11_kasOp*_asm10转化至DH5α感受态细胞，涂布于含阿泊拉霉素的抗性LB平板[0086]所述整合质粒载体pSET5035_kasOp*_smastC_kasOp*_asm11_kasOp*_asm10的整[0087](5)从抗性平板挑取克隆接种于含阿泊拉霉素的抗性LB液体培养基，小量提取质粒，并进行酶切验证，将测序正确的整合质粒载体pSET5035_kasOp*_smastC_kasOp*_asm11_kasOp*_asm10通过接合转移转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002感受态细胞中，并通的N_去甲基_4,5_去环氧美登醇的3_O_D_丙氨酰化为该生物转化的关键步骤，并且体外结[0100]电喷雾高分辨质谱(ESI_HRMS)测得实施例4所得化合物的准分子离子峰为m/z[0108]以5mg美登醇标品配制美登醇5mg/ml的标准溶液并进行梯度浓度稀释，获得浓度醇浓度和峰面积的标准曲线。根据所得标准曲线对美登醇产生菌株的提取物进行浓度测