CN119506422A 一种基于可编程酶系的kras g12c基因突变检测方法及应用 （上海交通大学）

一种基于可编程酶系的KRASG12C基因突变本发明提供了一种基于可编程酶系的KRAS提供了一种快速高效，检测灵敏度高的KRAS基因编辑酶Ago蛋白特异性切割KRAS野生型基因2furiosusAgo)、MfAgo(MethanocaldococcusfervensAgo)、TcAgo(Thermogladius4.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包含：(c)检测KRAS5.一种KRASG12C突变检测试剂，其特征在于，所述突变检测试剂包括向导ssDNA3一种基于可编程酶系的KRASG12C基因突变检测约50％的结直肠癌(colorectalcancer,CRC)和约20％的非小细胞肺癌(non_smallcell[0004]本发明的目的是提供一种基于可编程酶系的KRASG12C基因突变检测方法及应4[0014]在另一优选例中，所述剪切产物的大小为20_30nt，优选地22_28nt、更优选地[0015]在另一优选例中，所述剪切产物的大小为30_40nt、优选地33_37nt、更优选地(MethanocaldococcusfervensAgo)、TcAgo(ThermogladiuscalderaeAgo)、TfAgo(ThermusfiliformisAgo)、AaAgo(AquifexaeolicusAgo)、TpAgo(Thermus[0024]在另一优选例中，所述预扩增和富集引物在所述反应体系中的工作浓度为100_5μL，5μMPfAgo0.8μL，补充ddH2O至25μL；所述富集反应体系的反应条件为94℃预变性[0049]在另一优选例中，所述剪切产物的大小为20_30nt，优选地22_28nt、更优选地[0050]在另一优选例中，所述剪切产物的大小为30_40nt、优选地33_37nt、更优选地6[0058]在另一优选例中，所述预扩增和富集引物的工作浓度为100_300nM、优选地150_[0060]在另一优选例中，所述qPCR引物对可扩增DNA产物的长度包括50_110bp、优选地(MethanocaldococcusfervensAgo)、TcAgo(ThermogladiuscalderaeAgo)、TfAgo(ThermusfiliformisAgo)、AaAgo(AquifexaeolicusAgo)、TpAgo(Thermus7MnCl2[0091](S2)采用如本发明第一方面所述的反应体系、如本发明第二方面所述检测试剂、[0094](ii)使用预扩增和富集引物对，对所述样本进行PCR预扩增，从而获得预扩增产[0095](iii)使用预扩增和富集引物对、向导ssDNA和Ago酶，对预扩增产物中的KRAS8面所述的检测试剂在检测KRASG12C基因突变，和/或制备用于检测KRASG12C基因突变的[0116]图1显示gDNA引导PfAgo剪切KRAS野生型及KRASG12C突变型基因正链寡核苷酸片[0117]图2显示gDNA引导PfAgo剪切KRAS野生型及KRASG12C突变型基因负链寡核苷酸片[0118]图3显示gDNA引导PfAgo剪切KRAS野生型及KRASG12C突变型基因双链片段电泳[0119]图4显示预扩增(富集)引物退火温度对扩增效果的影响，泳道1_12分别对应的退[0120]图5显示qPCR引物退火温度对扩增效果的影响，泳道1_12分别对应的退火温度为[0123]经过深入而广泛的研究和大量筛选，本发明人首次将核酸扩增技术与PfAgo蛋白9的上限与下限之间和在该规定范围中的任何其他规定或中间值都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，但须遵守规定范围内的任何明确排除的限制。当规定范围包括这些限值中的一个或两个时，不包括那物样品中的微生物或DNA或RNA病毒获核苷酸或捕获引物杂交的靶核酸可以包含延伸超过捕获寡核苷酸的5'或3'末端的核苷酸，性的核苷酸序列，即能够选择性退火至靶多核苷酸(用，该相互作用导致形成双链体、三链体或其他更高等级的结构。通过沃森_克里克稳定性。多核苷酸与靶核酸的互补区域或基本上互补的区域退火的条件是本领域熟知的，IRLPress,Washington,D.C.(1985)以及Wetmur和Davidson,Mol.Biol.31:349(1968)中描从总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等等。通常参见Mullis等人，SpringHarborSymp.Quant.Biol.,51:263(1987)；Erlich,编著,PCRTechnology,编程的核酸酶系统。Argonaute系统可以包含工程化的和/或突变的Argonaute蛋白。Argonaute系统可以包含工程化的和/或编程的指导D个区域互补或基本上互补的区域以外的核苷酸序列。[0143]如本文所用，在富集靶多核苷酸的上下文中，术语“富集(enrich)”、“富集[0149]RAS表示一群具有189个氨基酸的密切相关的单体球状蛋白(21kDa分子量)，其与[0151]RAS亚家族中最值得注意的成员为HRAS、KRAS和NRAS，其主要牵涉许多类型的癌[0152]RAS基因的三种主要的同种型(HRAS、NRAS或KRAS)中的任一个的突变为人类肿瘤形成中最常见的事件之一。发现所有的人类肿瘤中约30％的肿瘤在RAS基因中携有一些突约13％的癌症发生、约43％的肺癌发生和几乎100％的MYH相关性息肉病(家族性结肠癌综存在来定义。Argonaute蛋白在物种之间高度保守，并且许多生物体编码该家族的多个成个至线虫蠕虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中的27个的范围内。在哺乳动物第22号染色体和第8号染色体上的基因编码。显示出了Argonaute蛋白家族的成员是由小Piwi相互作用RNA(piRNA)被锚定在特定的结合口袋中，并且指导Argonaute蛋白靶向mRNA还示出了，某些Argonaute蛋白由小DNA指导用于进行DNA切割。参见例如，Gao等人,嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAr5’磷酸化单链核酸或其衍生物包含与靶核酸的一个区域互补或基本上互补的靶特异性核异性核苷酸区域和靶核酸的一个区域之间存在四个碱基对错配。在一些实施方案中，在5’磷酸化单链核酸的靶特异性核苷酸区域和靶核酸的一个区域之间存在五个碱[0160]本申请使用的Argonaute包括源自天然存在的Argonaute系统的工程化的和/或编程的核酸酶系统。Argonaute系统可以包含工程化的和/或突变的Argonaute蛋白。酶对目标核酸序列的精确剪切；剪切位点位于与向导ssDNA的第10与11位核苷酸对应的目[0174]在一些实施方案中，本申请使用的引物具有与靶核酸的一个区域100％碱基对匹[0176]本发明的引物包括扩增待测样本中KRASG12C突变基因的预扩增和富集引物。在一个优选的实施方案中，所述qPCR引物对包括如SEQIDNO.19所示上游引物与如SEQID明的引物对也不限于与实施例中具体公开的探针配对使[0186]在本发明还提供了基于基因编辑酶Ago，比如PyrococcusfuriosusArgonaute优选经扩增后的靶标核酸分子)设计出向导ssDNA，所述向导ssDNA靶向于靶标核酸分子并导ssDNA使得PfAgo酶只剪切KRAS野生型基因，而不剪切KRASG12C突变基因，从而将KRAS[0192]本发明的检测试剂还包含PCR扩增使用的SEQIDNO.17所示上游引物、SEQID[0194]在本发明的检测试剂的基础上，本发明进一步提供一种检测KRASG12C基因突变[0199]目前，本发明基于新兴的多功能可编程核酸酶——PfAgo蛋白(来源Pyrococcus变检测技术。该技术将核酸扩增技术与PfAgo蛋白酶切反应相偶联，通过设计的引导DNA[0200]本发明所要解决的技术问题是提供一种快速高效，检测灵敏度高的KRASG12C基[0214]检测KRASG12C的预扩增和富集引物对可扩增DNA产物的长度为158bp，该长度可[0226]在本发明的一些实施方式中，检测样本选自有可能发生KRASG12C基因突变的肿[0229]在本发明的一些实施方式中，预扩增产物经过gDNA引导的PfAgo特异性剪切，将白血病、青少年癌症、儿童肾上腺皮质癌、AIDS相关的膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤(burkitt骨髓增殖性病症、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、肝外导管原位癌[0243]围绕KRASG12C基因突变位点区域分别设计合成60nt野生型和突变型的ssDNA靶饰，在gDNA第10/11分别引入一点错配，共计12条gDNA，剪切产物大小一般分别为25nt和[0247]根据合成的500bp基因序列设计A_Star富集引物：可以使用线上NCBIPrimer_[0248]针对KRASG12C富集产物的序列设计qPCR检测用的Taqman探针及对应引物。设计[0251]单链靶标的剪切，单链靶标为合成的KRAS野生型及KRASG12C突变型基因正负链80bp)各0.5μL，500bp双链靶标终浓度10nM，补充ddH2O至25μL。反应条件为94℃预变性靶标终浓度10nM，补充ddH2O至20[0258]该试剂盒包含的组分有2×PCR高保真Taq酶Mix，10μMPCR突变标准样品及含KRASG12C基因突变人血清[0262]预扩增反应体系为2×PCR高保真Taq酶Mix25μL，10μMPCR上下游引物各1μL，血清样本游离DNA并用dsDNA定量试剂盒进行