细菌内毒素检测药学

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!11/18/20191培训内容11/18/20192细菌內毒素检测旋光仪操作紫外分光光度计操作滴定装量检查可见异物PH值第一部分:细菌内毒素检测*3实验物品11/18/20194鲎试剂（注意灵敏度)BET用水（细菌内毒素检查用水)细菌内毒素工作标准品水浴锅（调节温度37±1℃)消毒酒精棉球（手部消毒和安瓿切口消毒)玻璃注射器干燥箱（灭菌用)实验方法--凝胶法11/18/20195鲎试剂按实验方法可分为:凝胶法鲎试剂—我们公司采用的实验方法动态浊度法鲎试剂终点浊度法鲎试剂动态显色法鲎试剂凝胶法原理凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.5ml/支或者更大装量，使用时应加除热原水（细菌内毒素检查用水)复溶后使用。凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。

11/18/201961鲎试剂灵敏度复核11/18/20197鲎试剂是一种有生物活性的试剂，其稳定性受

多种因素的影响，细菌内毒素检查法自药典收

载以来，每版都有明确规定：每个实验室在使

用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能

影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度

复核试验，其意义在于：①验证鲎试剂灵敏度

是否准确;②考查实验室条件;③考察实验人员操作技能;④验证细菌内毒素标准品的效价是

否准确。因此为了保证细菌内毒素检查法的准

确可靠性，检验人员应对每批新购入的鲎试剂

进行灵敏度的复核。这个是质检中心相关人员的实验内容。

2细菌内毒素标准品11/18/20198细菌内毒素工作标准品效价误差或效价不稳定,可影响实验结果,应标定细菌内毒素工作标准

品的效价。细菌内毒素标准品溶解后一定要在

旋涡混合器上混合15min,以后每一步稀释要

至少混合30s。如不按要求进行旋涡混合会使

所稀释的内毒素效价偏低,造成灵敏度标示偏

高,阳性对照不凝等不正确的实验结果。这个是质检中心相关人员的实验内容。

3细菌内毒素检查用水（BET水)11/18/20199BET水是一种特殊的灭菌注射用水，它不仅是要求细菌内毒素含量小于0.015EU/ml（凝胶法)，而且要求有严格的pH值（6.0～8.0)范围

。

4玻璃注射器处理11/18/2019101ml玻璃注射器12#不锈钢针头（20℃下一滴水的体积

是0.025ml，4滴为0.1ml)灭菌温度（180℃2小时以上)（250℃ 1小时以上)灭菌温度是等到干燥箱到达指定温度才

开始计时的。

鲎试剂选择11/18/201911我们公司都是使用0.1ml规格的鲎试剂。

包装规格2ml安瓿瓶我们公司鲎试剂的灵敏度有0.5EU/ml、 0.25EU/ml、0.125EU/ml、3个规格车间中检室规定用0.25EU/ml的鲎试剂来

做检查。（不要拿错了)氨基酸有用0.125EU/ml具体如下:11/18/201912标准0.5EU/ml有：氯化钠注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠

注射液、复方氯化钠注射液、氧氟沙星注射液、17AA-I、苦参碱

氯化钠注射液、利巴韦林葡萄糖注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液、标准0.35EU/mg甲硝唑注射液（经过计算）标准0.25EU/g甘露醇注射液（经过计算）标准0.125EU/ml有：18AA-Ⅱ、18AA-Ⅰ、18AA.盐酸克林霉素氯化钠注射液、乳酸环丙沙星氯化钠注射液、 15AA.乳酸左氧氟沙星注射液、18AA-Ⅳ、18AA-Ⅴ、果糖二磷酸

钠注射液、18AA-Ⅲ、诺氟沙星葡萄糖注射液、氟康唑氯化钠注射

液、曲可芦丁氯化钠注射液、氟罗沙星葡萄糖注射液、3AA.6AA.9AA.氨基酸注射液、17AA.小儿18AA-Ⅰ、批生产记录写偏差时候没必要每个品种都写内毒素。

热原的测定方法11/18/201913热原的分析、测定方法主要有：鲎试剂法和家兔法热原(progon)医院临床在使用药品注射剂时，常有发生冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、休克、严重时

导致死亡，这种症状称为热原反应。细菌内毒素（Endotoxin)细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（LipoplySaccharide)和微量蛋白（Protein)的复合物，它的特殊性不是细菌或细菌的代谢产物，而是细

菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活

性的物质热原的优缺点11/18/201914家兔热原检查法的优点，可在规定时间里观察到家兔的体温变化，相应反应了热原质引起哺乳类动物复杂的体温反应过程。所以，在半个多世纪以来热原检查法，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。但随着制药工业的发展和临床用药的要求，该方法的局限性越来越明显。这种热原检查法，只局限于某种药物进入体内（血循环)是否能引起体

温变化或热原反应作为判断药品是否污染热原的方法，已不能满足医药

工业发展的需要。其缺点：①标准化程度低，无法判断检查样品中存在的热原质到底是什么或是哪一种物质。②由于试验动物家兔是处在被细菌污染的环境中，通过吸入或皮肤感染细菌内毒素而被免疫，导致动物的个体差异较大。③试验动物受到药品的药理活性干扰，而影响体温变化（如放射性药品、抗生素、生物制品等)，实验结果难以判断。④设备及实验费用昂贵（如建设动物房、水电、动物饲料等耗费)，做一种药品需要几百元/次，而鲎试剂仅几十元/次。综上情况分析，鲎试验法可避免以上动物热原检查法的不足，该技术的成功和应用真可谓是药品质量监控一场大革命。

细菌内毒素11/18/201915热原是一种致热物质，有两种来源，一种是来自生产环境的污染程度，即产品的初始污染菌，这种致热原可用细菌内毒素的方法检测出来；而另一种致热原则来自于材料，材料对人体的致热程度是无法用细菌内毒素的方法检测出来的，必须用家兔法进行检查在药品生产质量管理规范（GMP)条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意味着不存在热原。

第二部分:旋光仪的操作11/18/201916操作及注意事项11/18/201917接通电源将随机所附电源线一端插220V/50Hz电源，（最好是

稳定电源)，另一端插入仪器背后的电源插座。接通电源后，打开电源开关（AC)，等待15min使纳

灯发光稳定。打开直流高能光源开关（DC)，此时钠灯直流供电下

点燃。清零：在已准备好的试管中注入蒸馏水放入仪器试样

槽或直接用空气清零,按“清零”键使显示为零。

测定比旋度与含量先按药典规定的浓度配制好溶液，依法测出旋光度，然后按下列公式计算比旋旋度：(a)=a/LC式中a为测得旋光度（度)C为溶液的浓度（克/毫升)L为溶液的长度即试管长度（分米)含量：通过测得的旋光度可用相应的计算公式得出被测物的含量。

11/18/201918注意事项11/18/201919一般情况下本仪器如在不放试管时示数为零，放入无旋光度溶剂

后（例如蒸馏水)测数也为零，但须注意倘若在测试光束的通路

上有小气泡或试管的护片上有油污、不洁物或将试管护片旋得过

紧而引起附加旋光数，则将会影响空白测数，在有空白测数存在时必须仔细检查上述因素或者用装有溶剂的空白试管放入试样槽后再清零。当不测量时注意及时关掉LIGHT（DC)灯光源，廷长钠灯和仪器

使用时间。旋光仪连续使用时间不宜超过4小时。如果使用时间

较长，中间应关熄10～15分钟，待钠光灯冷却后再继续使用，或

用电风扇吹打，减少灯管受热程度，以免亮度下降和寿命降低当测量完毕后，应放入干燥剂，注意保持仪器干燥。（数据不稳

定，一般情况下市湿度过高引起的)仪器的维修及保养11/18/2019201本仪器应安放在正常的照明、室温和湿度条件下使用，防止在高温度湿的条件下使用，避免经常接触腐蚀性气体，否则将影响使用寿命，承放本仪器的基座或工作台应牢固稳定，并基本水平。经过一段时间使用之后由于外界环境的影响，仪器的光学系统表面可能积灰或发霉，

影响仪器性能，可用小棒缠上脱脂棉花蘸少量无水乙醇或醋酸丁脂轻轻揩擦。如

有霉点可用棉花蘸酒精后，再蘸少量的氧化铈（红粉)或碳酸钙轻轻揩擦，光学

零件一般不轻易拆卸。光学零件一经拆卸就破坏了原来的光路，必须重新调整，

否则仪器性能将受影响甚至无法工作。若因故必须拆卸更换光学零件，应送厂家

解决。光路的检查：可用外径φ30mm的一个圆片放入试样槽中测试光束的入口处和出口处，

在较暗的室内光线下可以看到测试光束投射到此圆片上的光斑，此光斑应呈圆形

且与圆片基本同心，如光斑明显不圆，或明显偏离中心则必将影响仪器的性能，

应送厂家处理。测数校正：倘若由于某些其他因素，使仪器的测数偏离了正确值，可以用石英校正

管（可向厂家定购)或精确已知旋光度值的标准样品，在仪器上进行测试，考察

示数值与标准值是否一致，若测试结果超过允许范围，可进行测数校正。更换钠灯：钠灯在使用一段时间后（约几百小时)发光会明显变暗甚至完全熄灭，

使仪器不能正常工作，此时应更换钠灯，拆去仪器右测板上的通风板，拧松夹紧

钠灯的点容夹角上的螺钉，即可拔出钠灯进行更换。

第三部分:紫外分光光度计的操作huangyg:11/18/201921原理11/18/201922物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中

的某些特定波长的光能量，

相应地发生了分子振动能级跃迁和电

子能级跃迁的结果。由于各种物质具有各自不同的分子

、原子和

不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其

特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或

测

定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。分光光度分析就是根据物质的吸

收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。紫外可见分光光度法的定量分析基础是朗伯-比尔（Lambert-Beer)定律。即物质在一定浓度

的吸光度与它的吸收介质的厚度呈正比紫外分光光度计有定性和定量2种作用，定性一般是纯度检查，像透光度、5-羟甲基糠醛（中检员先现在有几个会的)，定性需要对照品来进行比对。像甲硝唑含量、色氨酸含量等UV1240紫外分光光度计11/18/201923操作方法：打开电源前，检查一下样品室内除比色皿架外，不应有其它物品

遗留，观察电压情况，电压处在220±22V内才开机；仪器自动进入初始化，约等待5min。当仪器完成初始化，显示出现方式菜单。操作。光度值测定方式。测定固定波长下样品的吸光度或透光率。选择"1.光度值”，设置波长，设定测定方式为"ABS”或"T”。光谱测定方式。在波长范围内扫描测定样品对不同波长的吸光度或透光率。选择"2.光谱”，设置波长范围，设定记录范围。定量测定方式。从标准样品制作的校准曲线，定量未知样品。选择"3.定量”，选择测定波长和测定方法。

注意事项与清洁方法11/18/2019241仪器应放在干燥的房间内，置于坚固平衡的桌子上。避免强光直接照射和化学气体侵入，要尽量注意不使灰尘落入。2为确保仪器稳定工作，电压变动较大的地方，220伏电源根预先稳压，应配备一台电子稳压或稳流器。3测定时，吸收池应选择配时，否则要引入测定误差，在规定波长下两个吸收池的透光率相关小于0.5％的作配对，或作测得透光率的数据校正减去亦可。4吸收池使用完毕，应立即洗净并用蒸馏水冲洗清洁，并用干净、柔软的绸布将水迹擦净，以防止表面光洁度破坏影响吸收池的透光率。若吸收池透光率内壁沾污，可用柔软绸布，滴上酒精液后，轻轻摩擦，再用蒸馏水冲洗清洁擦净。5光电管及放大部分均安装在光电管盒内，这部分不宜拆动。放大部分受潮后易漏电，使仪器不稳定。6对干燥剂的干燥性应经常注意，发现变色的，应立即更换，或加以烘干再用。其需放干燥剂有四处：①放大器暗盒、②单色器暗盒（打开主机后盖即可见到)、③单色器座壳上、④吸收池管架。当仪器不用时，亦应该定期烘干。7当仪器停止工作时，必须切断电源，选择开关放在“关”。

第四部分:滴定11/18/201925滴定管的构造特点11/18/2019261、滴定管分酸式滴定管碱式滴定管酸式滴定管-------玻璃活塞-------量取或滴定酸溶液或氧化性试剂。碱式滴定管-------橡胶管、玻璃珠-------量取或滴定碱溶液。2、刻度上边的小（有0刻度），下边的大。3、精确度是百分之一。即可精确到0.01ml4.下部尖嘴内液体不在刻度内，量取或滴定溶液时不能将尖嘴内的液体放出。现在市面上有聚四氟乙烯活塞的滴定管，可以酸碱两用的，我们公司也有，但是也要分酸式滴定管碱式滴定管

，不能混用。

使用时的注意事项及方法11/18/2019271、使用时先检查是否漏液。2、用滴定管取滴液体时必须洗涤、润洗。3、读数前要将管内的气泡赶尽、尖嘴内充满液体。4、读数需有两次，第一次读数时必须先调整液面在0刻度或0刻度以下。5.读数时，视线、刻度、液面的凹面最低点在同一水平线上。6、量取或滴定液体的体积==第二次的读数-第一次读数。滴定的时候要认真仔细，上一次换不同F值的滴定液，有中检员不同滴定液测出来含量相差2%，结果车间主任找到我这里来，我们自己滴定出来才相差0.31%一点要求11/18/201928车间经常换品种,所需要的滴定液,指示剂、试剂溶液等等,不能等到下班才来质检领,我们需要配制的时间。领用东西必须有质检的人在场。

第五部分:PH计11/18/201929操作11/18/201930使用方法：1使用前准备1.1在打开电源前先插好稳压电源，设置好房间温度，将pH复合电极插入电

极接口。1.2选择开关置"pH”档或"mv”档，开启电源，仪器预热30分钟。2仪器的标定2.1将pH复合电极用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸干电极上的水,选择两种

标准缓冲液(pH值相差约3)对仪器校正，先选择与供试品溶液pH值较接近的

标准缓冲液进行定位，调节定位旋钮使仪器读数与标示pH值一致。2.2再用另一种标准缓冲液核对是否与标示pH值一致(误差不大于±0.02)，如

不一致则需要调节斜率旋钮，使测定值与标示值一致。重复用两种标准缓冲液

校正，直到不需要调节仪器旋钮，读数与标示pH值相差不大于0.02为止。3供试品的测定3.1按规定取样或制备样品，置小烧杯中，用供试液淋洗电极3～4次，将电极

浸入供试液中，轻摇供试液，静置，待读数稳定后记录数据，,用纯化水洗净

后，需用下一供试液冲洗3～4次再测定。3.2弱缓冲液(如水)的测定，先用邻苯二甲酸氢钾标准缓冲液校正仪器后，更换

供试液进行测定，并重新取供试液再测，直到pH值的读数在一分钟内改变不超

过±0.05，然后用硼砂标准缓冲液校正仪器，再测定供试液。4.3.3当供试品

溶液测定完后，应用纯化水将电极冲洗干净，并用吸水纸擦干浸置于饱和KCl 溶液中。4关闭pHS-25型酸度计电源。

注意事项11/18/2019311在温度不同或所测pH范围不同时,因注意重新校正仪器。(每次

检测的时候都要养成随时看室温的习惯,并重新校准)2在供试液的测定时,二次pH值的读数相差应不超过0.1,取二次

读数的平均值为其pH值。3配制标准缓冲液与供试液用,应是新沸放冷除去二氧化碳的蒸馏

水或纯化水(pH5.5～7.0),一般可保存2～3个月,如有混浊或沉

淀则不能使用。4应注意保持仪器干燥,潮湿易引起漏电,接触不良易使读数不

稳。温度对电极电位影响很大,需注意环境温度。5新玻璃电极应在水中浸泡24小时后再使用,测定完后应将电极

用水冲洗干净并擦干浸入饱和KCl溶液中待用。6测量时,电极的引入导线须保持静止,否则将会引起测量不稳

定。7用缓冲溶液标定仪器时,要保证缓冲溶液的可靠性,如果缓冲

液有错,将导致测量结果的误差。8电极取下帽后应注意,在塑料保护内的敏感玻璃泡不与硬物接触 ,任何破损和擦毛都会使电极失效。测量完毕不用时应将电极保

护帽套上,帽内应放少量补充液,以保持电极球泡的湿润。

仪器维护与保养1