《高粱品种鉴定 IDP分子标记法》编制说明

《高粱品种鉴定IDP分子标记法》

（报批稿）

编制说明

一、目的意义

我国高粱种植面积和产量正逐年增加。在中国酿造业拉动下，近年来高粱种植

迅猛发展。高粱种植面积在2015-2021年间增幅58.86%，年均复合增长率约8.01%；

产量增幅为42.26%，年均复合增长率约6.05%。高粱同时作为高产优质饲草，其市

场活跃度和生产总值正逐年增加。我国高粱产业化快速增长趋势已带动高粱种植业

的显著进步。

江苏作为我国酿酒产业强省之一，对高粱需求量大、品质要求高。江苏省苏北

洪淮地区因其人文、地理优势集中了多个国内一流知名白酒企业（洋河、国缘等），

2021年我省白酒产能已达10.18万吨。但省内现有高粱种植面积少，当前90%以上

高粱原料依赖进口或外调，而原料品质将直接影响最终白酒的产量及品质，关系企

业品牌价值。

制定高粱品种鉴定技术规程，利于企业把控原料品种及品质。不同风味的白酒

酿造所需高粱原料相差甚大，如酱香型贵州茅台专用品种为红缨子，而我省浓香白

酒酿造的高粱原料以晋糯3号和红糯16为主。流通的高粱品种不详、品质层次不齐

的市场问题，显著不利于我省白酒企业的原料品种和质量把控。为了利于我省流通

原料或种植高粱的市场监管，制定高精准、短周期的高粱品种鉴定技术规程，严格

把控高粱品种的准确性，迫在眉睫。

相较其他分子标记，IDP标记分辨率和精准度更高、鉴定周期更短。InDe（lInsert

anddelete）是指一个基因型的基因组中相对于其他基因型有一定数量的核苷酸插入

或缺失。根据InDel位点多态性设计PCR引物的扩增标记即为IDP（Insertion-deletion

polymorphism）标记。该标记法优势在于：1).与目标基因功能关联，更利于分子辅

助筛选和鉴定；2).可筛选片段差异大于50bp，便于分离和精准鉴定；3).分离方式可

使用最常见的琼脂糖电泳，简捷、方便，分析周期短，运行成本低。目前在番茄等

作物中已制定该标记相关的国家行业标准（NY/T2471-2013）。

目的意义。当前江苏省白酒酿造业的稳定、可持续发展迫切需要更精准、更高

效的高粱原料分子鉴定技术规程，而现有分子标记法分辨率低、分析周期长的缺点

一定程度限制了我省流通原料或种植高粱的快速、精准鉴定。本项目立足于IDP标

—1—

记分辨率和鉴定准确度高、操作性强、鉴定周期短、运行成本低等优势，基于泛基

因组分析技术自主开发、筛选出包含粒用和饲用高粱在内的通用型IDP分子标记，

为我省高粱属品种分子鉴定及品种权保护提供更有利的技术创新。

二、任务来源

2023年8月，江苏省市场监督管理局发布《关于下达2023年度江苏省地方标准

项目计划的通知》（苏市监标〔2023〕173号），批准了江苏省地方标准修订项目计

划第115项《高粱属品质鉴定InDel分子标记法》的立项。

经专家组讨论，将标准的适用范围从“高粱属”修改为“高粱”；依据NY/T2594

《植物品种鉴定DNA分子标记法总则》中对分子标记类型的界定，“InDel”应使

用“IDP”，综上原因，标准名称修改为《高粱品种鉴定IDP分子标记法》。

三、编制过程

（一）项目启动阶段

2023年9月，由江苏省农业科学院、中国农业科学院生物技术研究所、贵州省

旱粮研究所等单位成了标准起草小组，本项目正式启动。

（二）起草编制阶段

1.高粱属种质资源收集及扩繁。

收集全世界高粱属种质资源276份。其中135份来源于贵州省旱粮研究所，80

份来源于国家农作物种子资源中期库（江苏），61份来源于江苏省牧草种质资源库，

具体种质信息如表1所示。对276份高粱属种质进行浸种催芽、取样和提取DNA。

表1276份高粱种质资源基本信息。

来源地区数量品种、品系或基因型名称

黑龙江5龙杂17,龙杂18,龙杂20,龙杂21,糯粱1号

吉林9吉杂124,吉杂127,吉2055B,糯早6,凤杂11,凤杂104,凤杂34,凤杂56,吉杂227

辽宁10辽杂19,辽杂21,辽杂37,辽粘3号,辽糯11,沈杂5,402B,405B,407B,锦杂109

河北6冀酿1号,冀酿2号,冀酿4号,冀酿7号,R280,红茅粱6号

晋粱5,晋杂22,晋杂34,晋杂35,晋杂37,晋糯3号,晋糯101,晋糯102,晋糯105,

山西10

红糯16

内蒙古3赤杂106,通杂108,通杂136

—2—

山东6鲁粱5号,济糯粱1号,济粱1号,济粱2号,冀酿1号,冀酿4号

川糯粱1号,川糯粱5号,金糯粱1号,金糯粱5号,金糯粱1号,金糯粱272,卢糯8

四川10

号,郎糯红19,郎糯1号,泸州红1号

红缨子,黔高7号,黔高8号,红珍珠,红粱丰1号,红壳糯,黑壳糯,红茅糯6号,茅

贵州9

高9号

M3A01100191,M3A01100193,M3A01100194,M3A01100196,M3A01100199

,M3A01100200,M3A01100201,M3A01100202,M3A01100203M3A01100204

,M3A01100206,M3A01100207,M3A01100208,M3A01100209,M3A01100211

,M3A01100212,M3A01100213,M3A01100218,M3A01100224,M3A0110022

5,M3A01100227,M3A01100228,M3A01100229,M3A01100230,M3A011002

31,M3A01100232,M3A01100233,M3A01100234,M3A01100235,M3A01100

江苏省地方236,M3A01100237,M3A01100238,M3A01100239,M3A01100240,M3A0110

种质（国家0241,M3A01100242,M3A01100243,M3A01100245,M3A01100246,M3A011

农作物种子8000248,M3A01100249,M3A01100250,M3A01100251,M3A01100253,M3A01

资源江苏中100256,M3A01100259,M3A01100260,M3A01100262,M3A01100263,M3A0

期库）1100264,M3A01100265,M3A01100266,M3A01100267,M3A01100268,M3A

01100269,M3A01100271,M3A01100274,M3A01100276,M3A01100278,M3

A01100279,M3A01100280,M3A01100282,M3A01100283,M3A01100284,M

3A01100285,M3A01100286,M3A01100287,M3A01100289,M3A01100290,

M3A01100291,M3A01100292,M3A01100294,M3A01100295,M3A01100296

,M3A01100297,M3A01100298,M3A01100299,M3A01100300,M3A0110030

4,M3A01100304

92-Ⅱ-37,92-Ⅱ-398,92-Ⅱ-233,92-Ⅳ-17,92-Ⅴ-255,92-Ⅱ-314,92-Ⅰ-7,92-Ⅴ-365,9

贵州省地方2-Ⅴ-114,92-Ⅴ-480,92-Ⅴ-73,92-Ⅳ-18,93-Ⅳ-6,93-Ⅱ-2,93-Ⅰ-18,93-Ⅱ-25,93-Ⅱ-1

种质（贵州3,93-Ⅱ-10,93-Ⅱ-1,93-Ⅰ-19,93-Ⅰ-3,93-Ⅳ-47,93-Ⅱ-1,97-23,97-26,97-05,97-47,9

67

省旱粮研究7-55,97-56,97-60,97-63,8015,8025A,8029,8030,8032,8037,8040,8041,8050,8

所）051,8053,8060B,8067,8071,8072,8074,8078A,8078B,8080,8086,8087,8088,8

091

BTx623,Rio,Tx430,ICSH12,ICSH19,ICSH22,ICSH27,ICSH33,ICSR121,ICS

国外种质V1,ICSV-114,ICSV-133,ICSV233,M-60346,M-60350,M-60352,Clubkafer#9

(江苏省牧01,Drougt14,EarlysumacSorgo,Earlyredkafir#866,Earlywhitemilo#480,IS-010

44

草种质资源2,IS-0158,IS-0170,IS-0185,IS-0416,IS-0452,IS-0466,IS-0469,IS-0508,IS-063

库)0,IS-1526c,IS-2217,IS-2279,IS-2319,IS-3911c,IS-3952,IS-4806,IS-5530C,IS-

3974,CP110001,CP110003,CP110045,CP110053

饲用品种及

苏牧3号,苏丹草2098,拟高粱,甜高粱江苏地方种,大卡甜高粱,苏丹草江南,

种质(江苏

17高丹草多糖,中科甜438,中科甜968,大力士,高丹草得力,冀草6号,甜高粱海

省牧草种质

迪,高丹草黑贝,中科甜1号C4,中科甜2号C9,甜高粱绿巨人

资源库)

2.高粱属IDP位点筛选。

对已发表的13个参考基因组进行大片段比对并筛选片段>25bp的高频二态性缺

失位点，并依据染色体物理图谱均匀分布的筛选原则，共计获得有效IDP位点540

—3—

个。

3.高粱属IDP位点引物筛选。

对276份高粱属种质DNA等份混合获得12个基因池，筛选560个IDP位点的

引物，获得高频位点111个。

4.高粱属核心IDP标记的确定。

优化111个位点的引物至琼脂糖电泳无杂带后，对276份高粱属种质逐一进行

分析，获得遗传多样性矩阵。进行聚类等差异分析后发现，可完全区别276份高粱

属种质。依据染色体物体图谱均匀分布的筛选原则，每条染色体保留不同物理位置

的标记共6条，且PCR扩增产物在1200bp之内（荧光毛细管电泳的最大检出区间），

并结合对276份种质的区分力，最终获得60对IDP核心引物。

5.核心标记测序和毛细管荧光电泳验证。

依据高粱属Harlen&Wet的Bicolor/Caudatum/Durra/Guinea/Kafir分类法，挑选

以上5类中的6个代表性种质：BTx623、Rio、Tx430、红缨子、甜高粱江苏地方种

和苏丹草2098。对以上60对核心IDP引物的6个代表性种质PCR扩增片段逐一基

因Sanger测序验证，测得序列Blast参考基因组后确定与设计位点的物理位置和序列

相同，6个代表性种质的测序片段比对后确认IDP真实存在，且无第三等位片段。对

正向引物5’碱基进行6-FAM荧光标记修饰后，进行核心引物PCR产物的毛细管荧

光电泳，扩增的PCR产物均能获得清晰、稳定的主峰，且易于识别，并确认6个代

表性种质的片段多态性与测序大小相符。

6.第三方检验机构技术验证。

由农业农村部植物新品种测试中心及重庆分中心、农业农村部长江下游棉花与

油菜重点实验室对本标准进行重现性、稳定性、一致性的验证工作。三家验证单位

均出具了验证合格报告。

（三）标准研讨阶段

由江苏省农业科学院、中国农业科学院生物技术研究所、贵州省旱粮研究所等

单位组成的标准起草小组，经研讨修改形成标准征求意见稿。

—4—

（四）征求意见阶段

共征求了18个单位的意见，其中有18个单位回函，征集到有效意见100条。

工作小组经过内部讨论，根据意见对标准文本进行修改，并对修改后的标准文本进

行通稿阅读，就《高粱品种鉴定IDP分子标记法》等作了进一步细化完善，形成标

准送审稿。经统计，征集到的100条有效意见中，采纳58条，部分采纳8条，未采

纳34条。

（五）审查报批阶段

2025年5月，江苏省市场监督管理局在南京组织召开《高粱属品种鉴定InDel

分子标记法》江苏省地方标准技术评审会，审查专家组由中国作物学会、江苏省农

学会、江苏省植物生理学会、江苏省农业技术推广协会、淮安指示产权保护中心的5

位专家组成，并邀请行政主管部门江苏省农业农村厅质监处和种植业处领导参会指

导。会上，审查专家对标准送审材料进行了审查。专家组一致同意标准通过审查，

并就标准的相关表述提出了完善的建议。工作组根据审查会专家意见，修改形成标

准报批稿。

四、主要内容

（一）编制原则

根据高粱属品种的特点，按照农业农村部制定的《植物品种鉴定DNA分子标

记法总则》标准编写要求，采用以下原则编写《高粱属品种鉴定IDP分子标记法》：

规范性原则：本标准的制定符合法律法规，符合有关标准要求，包括GB/T

1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》、GB/T3543.1

《农作物种子检验规程总则》、GB/T3543.2《农作物种子检验规程扦样》、GB/T

6682《分析实验室用水规格和试验方法》。

适用性原则：本规程的全部内容具有可操作性，本标准适用于高粱属各类（粒

用和饲用）高粱及苏丹草品种的鉴定。

统一性原则：本规程与现行相关标准协调统一，不发生冲突。

先进性原则：本规程采用利用国际前沿的泛基因组分析技术获得高粱属基因组

—5—

二态性、大片段、高频InDel位点并开发IDP标记，以琼脂糖凝胶电泳结合荧光毛

细管电泳的高粱属鉴定技术，证明采用IDP标记技术检测高粱属品种真实性可以保

证检测结果的规模化、准确性和时效性。该方法的先进性在于检测方法简便、时间

短、数据统计分析简单、易实现数据共享、重复性稳定性较高。

（二）标准主要内容

1.引物筛选

利用已发表13个高粱属不同种质基因组序列与高粱测序品种BT×623参考基因

组序列进行比对。利用软件MUMmer进行大片段同源序列比对筛选目标区域中序列

差异≥25bp的IDP位点560个，利用PrimerPremier6.0软件设计IDP标记引物。引

物设计的条件：PCR扩增产物长度为100-1200bp；变性温度（Tm）在54-63℃之间；

引物长度在18-30bp。

本标准自主开发了一种快速预测IDP标记最小等位基因频率的方法，在不需要

逐一分析大群体中单个样品的前提下，快速准确的测算出该标记的MAF值。具体方

法为：将种质资源分别提取DNA后，n数量基因型等份混池共获得N个混池样品，

再分别对N个混池DNA进行特异引物的PCR，所得N个产物二次混池为一个最终

产物，利用4%琼脂糖进行电泳分离，对同一泳道上的不同IDP条带强弱进行量化分

析后，计算MAF（%）=Intensity(弱带)/[Intensity(弱带)+Intensity(强带)]*100。预测

MAF方法如图1所示。

因此，等体积取母液浓度为200ng/μL的单个种质DNA并随机混合13个种质

DNA于一个离心管内即为一个混池DNA样品，276个种质共计获得12个混池DNA

样品。利用合成的560对引物对12个混池DNA样品进行PCR，扩增程序为63-57℃

的降落PCR。扩增结束后将12个混池DNA的PCR产物混匀至一个离心管内后，在

进行4%浓度的琼脂糖凝胶电泳。经以上方法预测出111对IDP引物的MAF>5%。

—6—

图1高粱属IDP标记MAF预测流程。

2.核心引物的确定

利用筛选出的111对高频IDP引物对276份高粱种质DNA进行逐一分析，依据其二

态性获得遗传多样性矩阵，并利用Neighbor-joining(NJ)聚类法构建系统发育树，如

图2-A所示。为了便于观察引物的区分力，特在数据组中插入JS172VSJS172_2的重

复对照，JS172和JS172_2的多态性数据完全相同。结果显示，除JS172VSJS172_2（图

2-A，红色）以外，其他种质间均存在显著遗传距离，说明115对高频IDP引物可完全

区分276份高粱属种质。

依据引物对物理位置、MAF值及兼容毛细管荧光电泳（最大片段<1200bp）的原

则，优选60对引物构建NJ系统发育树，如图3-B所示。结果中仍然除JS172VSJS172_2

（图2-B，红色）以外，其他种质间均存在显著遗传距离，说明该60对引物的区分力

足以辨别276份高粱属种质，特认定为核心引物，编号WS01-60。此外，将核心60对

引物数量降至30个后的高粱属种质遗传多样性矩阵进一步构建NJ系统发育树，如图

2-C所示，出现了除JS172VSJS172_2对照外的大量种质重复，说明缩减60对核心降

低了种质区分力。

分别对以上60对引物的扩增产物进行Sanger双向测序后并BLAST高粱属测序品

种BT×623参考基因组，确认其扩增序列染色体物理位置与设计位置相符。具体物理

位置如图3所示。

—7—

依据高粱属数据库中品种间差异位点的分布，综合考虑实际检测过程中种子批

次、试剂等对检测结果的影响，结合DUS表型数据并参考国家行业标准，将检测结

果判定阈值定为2，当2个样品差异位点数≤2时，判定为“疑同”；差异位点数＞2，判

定为“不同”。

图2高粱属276份种质的系统发育树对比。

Chr.01Chr.02Chr.03Chr.04Chr.05Chr.06Chr.07Chr.08Chr.09Chr.10

STARTSTARTSTART

0STARTSTARTSTARTSTARTSTARTSTARTSTART

WS07WS19WS37

WS01WS13WS25WS31WS43WS55

WS02WS32

5WS44WS49

WS08WS20WS38WS56

10WS45

WS14

WS03

WS26WS50

15WS09WS51WS57

WS27

20WS15WS21

WS04WS39

25

30

35

WS16

WS58

40WS28

WS22WS33

45WS34

WS10

WS52

50WS46

WS35WS47WS53WS59

WS40

55WS11WS17

WS29WS41WS54WS60

WS23WS36

60WS48End

EndEnd

WS05End

WS24WS42

65End

EndWS30

70

End

WS18

75End

WS12

End

WS06

80

End

图3高粱属60对核心IDP标记染色体物理图谱。

3.引物带型和峰型

以4%琼脂糖电泳对参考样品BTx623、Rio、Tx430、红缨子、甜高粱江苏地方

种、苏丹草2098/苏牧3号6组样品的60对核心引物进行电泳，其电泳带型如图4

—8—

所示。仅甜高粱江苏地方种在WS11引物出现缺失位点，其他核心引物中至少有一

份种质的IDP多态性与其他种质不同。WS04引物为拟高粱特异标记，仅在含有拟高

粱遗传背景的苏牧3号中有特异带。WS14引物中仅苏丹草含有杂合带型。

以毛细管荧光电泳对以上参考样品的60对荧光修饰引物PCR产物进行验证，

其WS04和WS05的毛细管全谱比较如图5所示，谱图中均检测到显著单峰。60对

核心引物的荧光毛细管电泳单峰比较如6所示，所得PCR产物大小与Sanger测序结

果相符。

—9—

图4高粱属60对核心IDP标记的琼脂糖电泳条带图。

—10—

图5高粱属IDP标记毛细管荧光电泳全谱比较。

—11—

图6高粱属60对核心IDP标记的毛细管荧光电泳单峰比较。

4.DNA指纹数据库的建立

利用60对核心IDP引物对276份高粱属种质进行遗传多样性检测，建立高粱属

品种保护IDP指纹数据库。6组参考样品BTx623、Rio、Tx430、红缨子、甜高粱江

苏地方种、苏丹草2098/苏牧3号的IDP位点多态性大小（bp）如表2所示。60对

核心IDP引物MAF值范围为2.8-49.3%，平均MAF值为29.21%。仅WS04标记MAF

值＜5%，其他均高于5%。60对引物仅在WS11位点出现部分缺失，缺失率低，可

用性好。

—12—

表2高粱属60对核心IDP标记遗传多态性。

参照品种IDP位点多态性（bp）

引物名称染色体位置MAF(%)

BTx623RioTx430红缨子甜高粱地方种a苏丹草/b苏牧3号

1WS011115012312311501150a115043.1

1WS021241428428428428a42826.1

1WS031778778529529529a77827.5

1WS041816816816816816b3282.8

1WS05147711534771153477a115335.9

2WS061301301259301301a30110.1

1WS072351296296296296a29625.0

1WS082283496283496496a49633.3

1WS092132180180132180a13228.6

1WS102243243243590590a24339.5

1WS112277501277501/a27748.9

1WS122814814814515515a81423.9

1WS133278278355355355a35519.2

1WS143689418689418689ac418/68946.3

1WS153257529529257529a25732.6

1WS163195195567195195a19510.9

2WS1731141114111414261141a114140.0

2WS183959959644959959a95949.3

2WS194161161161209161a20944.9

1WS204158107158107107a15827.5

1WS214302302302219219a30240.2

1WS224539310310310310a53930.8

1WS234187187187435435a43529.3

1WS244263486486486486a48629.7

2WS255406190190190190a19015.9

1WS265123123150123123a12326.1

1WS275264362362264362a26443.5

2WS285193193193193193a87918.5

1WS295531531531170170a17014.5

1WS305211247211247247a21142.0

1WS316500149500500500a14919.2

1WS326491658658658658a65825.7

1WS336257257257502502a25743.8

1WS346597362362362362a36210.9

1WS356128168128128128a12823.6

1WS366498153153153153a15312.0

1WS377156156885885885a15637.3

1WS387298298485298298a2988.7

1WS3971005156156156156a15610.5

1WS407300300300300300a3486.9

1WS417396396396335335a33549.3

1WS427225225458225225a22521.0

1WS438184184184422422a18449.3

2WS448190190190190190a25638.8

1WS458373136136373373a37327.5

1WS468172172418418418a17244.6

1WS478416179179179416a41618.8

1WS488833833599599599a59919.9

1WS499353353353146146a35340.6

1WS509183123123123123a18316.3

1WS519435435435435435a1985.4

1WS529428660428428660a42847.5

2WS539162107162162107a16248.2

1WS549207553207207207a55326.8

1WS551010361036373373373a103626.8

1WS5610235235235481235a23544.3

1WS5710644644644976976a64445.8

1WS581068117611766868a117627.1

1WS5910332332332332565a33237.3

1WS6010423423423304423a42342.0

平均29.21

注：表中1和2分别表示TD-PCR反应程序1和2，a表示苏丹草2098的IDP位点，b表示‘苏牧3号’（拟高粱×苏丹草杂交种）

的IDP位点，c表示杂合IDP位点，“/”表示位点缺失。

—13—

5.同名品种比对

以贵州省旱粮研究所测序的红缨子为参照样品（图7），样品A和样品B分别来

源于河北汉青种业有限公司和太谷县大志种业有限公司。样品A和B与参照样品分

别存在3和5个差异位点，判定为不同品种。

图7同名商用高粱‘红缨子’的IDP引物检测比较。

6.第三方检验机构技术验证报告

标准研制单位联合国内新品种鉴定权威机构及具有丰富育种经验的科研单位对

标准进行重现性、稳定性、一致性的验证工作，农业农村部植