CN119517151A 一种特征基因集的筛选方法及其在药物筛选中的应用 （华中科技大学）

一种特征基因集的筛选方法及其在药物筛选中的应用本发明公开了一种特征基因集筛选方法及强ICB抗癌能力的化合物或组合物，跳出了现有2步骤G2：用步骤G0得到的相关表型分组的基因表达数据行富集分析，所述的基因富集分析是在所述的两个相同或相近的相关表型分组之间进行；的具有功能注释的各基因集在步骤G0所得各基因表达数据集分组中富集结果正向显著之(A)设置富集结果显著基因集筛选阈值：包括上调显著基因集的筛选阈值(X)和/或下所述对筛出的各上调显著基因集中的基因进行优化的方法是：提取所述对筛出的各下调显著基因集中的基因进行优化的方法是：提取32.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤G2步骤G0中所述的至少两个相同或相近的与筛选特征基因集所做研究或应用之目的相因表达数据集为治疗前或/和治疗后的基因表达数应的基因标志物组成的基因集是ImmuCellAI工具提供的免疫细胞对应的标志的基因标志物共同组成的基因集具体是ImmuCellAI工具提供的杀伤性细胞对应的标志基先筛选第二特征基因集所属的显著基因集，包括筛选上调显著基因集和/或下调显著征基因集所属显著基因集的筛选阈值(X)，Y'小于下调第一特征基因集所属显著基因集的4再对筛选出的各上调和/或下调第二特征基因集所属的显著基因集中的基因进行优化：所述的对筛选出的上调第二特征基因集所属的显著基因集中的基因进行优化的方法筛选阈值β检测各上调显著基因集对应的富集结果显著的前对应的富集结果显著的前沿子集L中各基因出先筛选第三特征基因集所属的显著基因集，包括筛选上调显著基因集和/或筛选下调于上调第二特征基因集所属的显著基因集的筛选阈值Y，Z'小于下调第二特征基因集所属所述筛选上调显著基因集的方法是：若步骤G1中收集的某个基因集在多于或等于Z且保留的基因集为下调第三特征基因集所属的再对筛出的各上调和/或下调第三特征基因集所属的显著基因集中的基所述对筛出的各上调第三特征基因集所属的显著基因集中的基因进行优化的方法是：提取富集结果中各上调第三特征基因集所属的显著基因集对应的富集结果显著的前沿子选阈值丫检测各上调显著基因集对应的富集结果显著的前沿子集所述的对筛出的各下调第三特征基因集所属的显著基因集中的基因进行优化的方法所设基因优化筛选阈值丫'检测各下调显著基因集对应的5步骤一：按照权利要求1至9中任意一项所述的方法得到步骤三：用富集分析方法对得到的基因扰动数据计算出特征每个被筛选化合物或组合物扰动数据中的富集分数NES和富集显著性检验值P，所述P为p_对各组基因表达数据集的基因表达数据进行富集分析分组，得到以下所列5个富集分联合协同治疗组及免疫检查点抑制剂组vs.对照组；⑤联用免疫检查点抑制剂治疗和协同记录富集分组的分组数(H)，即得到H个富集分组，用特征基每个基因集对得到的富集分组进行富集分析，得到标准化后的富集分数NES和显著性检验6物时的基因表达变化值的数据，即得到每一个被筛选化合物或组合物对应的基因扰动数数据计算出所述母特征基因集在每个被筛选化合物或组合物扰动数据中的标准化富集分0.0001；将与所述母特征基因集抑制的扰动数据对应的富集结果中的NES值设为负样本数……代表特征基因集在候选化合物的扰动表达数据的GSEA结果中的NES数1化合物越有可能为目标化合物；优选LASSO回归或弹性网络回归的机器学习方法进行所述M2：CD79A,CD19,CD79B,C7VAV1,BTK,SYK,zPIK3CD,PIK3R5,NFKBIA,LYN,CR2,LILRB3,NFKB8免疫检查点抑制剂之协同药物的筛选及用于筛选免疫检查点抑制剂之协同药物的特征基9的基因表达数据集进行分组并记录分组数(N)，分组的原则是：每个基因表达数据集为一收集的具有功能注释的各基因集在步骤G0所得各基因表达数据集分组中富集结果正向显即Q<Q1时，为富集结果正向显著；优选地，所述的自行设定之假设检验阈值Q1的取值小于[0010](A)设置富集结果显著基因集筛选阈值：包括上调显著基因集的筛选阈值(X)和/因表达数据集分组之组数N，优选X和/或X'取值为所述组数N之数值的四分之三至四分之法是：如果某个基因集在多于或等于X'个基因表达数据集中富集结果负向显著，即N[0012]上述步骤G0中所述的至少两个相关表型分组可以是以下①至③所述各项中的任志物共同组成的基因集具体是ImmuCellAI工具提供的杀伤性细胞对应的标志基因组成的[0015]先筛选第二特征基因集所属的显著基因集，包括筛选上调显著基因集和/或下调一特征基因集所属显著基因集的筛选阈值(X)，Y'小于下调第一特征基因集所属显著基因集；[0016]再对筛选出的各上调和/或下调第二特征基因集所属的显著基因集中的基因进行[0017]所述的对筛选出的上调第二特征基因集所属的显著基因集中的基因进行优化的优化筛选阈值β检测各上调显著基因集对应的富集结果显著的前沿子集L中各基因出现的[0018]所述的对筛选出的下调第二特征基因集所属的显著基因集中的基因进行优化的优化筛选阈值β'检测各下调显著基因集对应的富集结果显著的前沿子集L中各基因出现的[0021]先筛选第三特征基因集所属的显著基因集，包括筛选上调显著基因集和/或筛选步骤G1中收集的某个基因集在多于或等于Z'且小于Y'个基因表达数据集中富集结果负向[0024]再对筛出的各上调和/或下调第三特征基因集所属的显著基因集中的基因进行优[0025]所述对筛出的各上调第三特征基因集所属的显著基因集中的基因进行优化的方化筛选阈值γ检测各上调显著基因集对应的富集结果显著的前沿子集L中各基因出现的情[0026]所述的对筛出的各下调第三特征基因集所属的显著基因集中的基因进行优化的依据所设基因优化筛选阈值γ'检测各下调显著基因集对应的富集结果显著的前沿子集L集在每个被筛选化合物或组合物扰动数据中的富集分数NES和富集显著性检验值P，所述P[0032]本发明提供的基于特征基因集筛选方法的免疫检查点抑制剂之协同药物的筛选[0035]对各组基因表达数据集的基因表达数据进行富集分析分组，得到以下所列5个富检查点抑制剂组vs.对照组；③联合协同治疗组及免疫检查点抑制剂组vs.单用协同治疗中的每个基因集对得到的富集分组进行富集分析，得到标准化后的富集分数NES和显著性0.0001；将与所述母特征基因集抑制的扰动数据对应的富集结果中的NES值设为负样本数……代表特征基因集在候选化合物的扰动表达数据的GSEA结果中的NES数1化合物越有可能为目标化合物；优选LASSO回归或弹性网络回归的机器学习方法进行所述[0039]所述的协同治疗为能与免疫检查点抑制剂联合使用发挥协同治疗作用的技术手[0040]所述的基因表达数据集为RNA_seq原始数据、表达谱芯片原始数据或通过生物信[0041]本发明提供的用于筛选免疫检查点抑制剂协同药物的特征基因集包括在本发明[0048]M2：CD79A,CDVAV1,BTK,SYK,zPIK3CD,PIK3R5,NFKBIA,LYN,CR2,LILRB3,NFKB者显著性检验值进行筛选必定有疏漏，这种疏漏注表型的分组)筛选出这些具备同样微小变化的基因。并且本发明方法通过自行设定多个黑色素瘤和肺癌)和数据集(LINCS第二阶段和2020数据)的不同小鼠实验的重复中都得到[0054]图1是10个ICB临床治疗数据集GSEA富集结果(18个注释基因集)的气泡图可视化展示，对勾所在的气泡为正向富集显著的结果小，气泡上标注的数值为标准化后富集分数NES(图中仅展现了adjustp_value<0.05对应[0055]图2是实施例1中的步骤3中以AntigenProcessingandPresentation(注释基因[0056]图3是实施例6中所述方法筛选药物在A375细胞系中的前20个结果，其中圈出的3个化合物为实施例7中进行小鼠体内实验验证瘤体积差异极其显著，即联用anti_PD_1抗体和Miglitol的药效显著地(*代表p_value<单用MG_132在第8天后的治疗效果略优于单用anti_PD_1组的治疗效果，由此表明单用MG_PBS组(对照组)差异显著，且单用Taltirelin在第8天anti_PD_1+Taltirelin对应的各组小鼠生存曲线对比图，图中『Log_rank(Mantel_Cox)林(taltirelin)对于小鼠的生存期相对于其余组提[0064]图11是实施例8药效学实验4组(再次进行Taltirelin联合anti_PD_1的药效学实Taltirelin对应的各组小鼠肿瘤体积曲抗体和Taltirelin的药效要极其显著地(***代表p_value<0.001，****代表p_value<组)差异显著，且单用Taltirelin在第8天后的治疗效果略优于单用anti_PD_1组的治疗效test进行两两显著性检验，两两统计学差异均显著(Adjustp_value<0.05)采用False明Taltirelin联合免疫检查点抑的药丸图形的为已经被明确报道具备增强ICB抗肿瘤效果的化合物，圈圈标记的化合物是发生小鼠死亡或者肿瘤体积超过伦理限制则anti_PD_1组小鼠的治疗效果均显著显著[0073]1、基因表达数据收集：下表为收集的ICB治疗前的临床RNA_seq样本，数据来自NCBIGEO和dbGap数据库；为了数据包括每个患者接受ICB治疗后是否响应的临床治疗信或部分反应(PR)定义为反应(R)组，将稳定疾病(SD)或进展性疾病(PD)定义为无反应(NR)SingnalingPathway、NaturalKillerCellCytotoxicity、CytotoxicityofPresentation为例，具体筛选方法如附图2所示，图2将气泡图转换为了可视化更为详细的集显著的7个数据集曲线上标注了图形“对勾”，富集不显著的3个数据集上标注了图形“叉”，将富集显著的7个数据集的leadingedgesubset提取出来，得到编号1_7共7个leadingedgesubset，如果一个基因在其中的5个或5个以上leadingedgesubset中出的精度。[0081]同理，其余3个基因集TCRSingnalingPathway、NaturalKillerCell[0085]收集扰动数据：以LINCS数据库提供的大量小分子化合物的扰动数据为药物筛选[0087]实施例2中得到了数量庞大的候选药物，其中不乏许多已经报道被证实能协同增因集进行GSEA富集分析，同时满足NES>0且adjustp_value<0.05的结果即为目标候选药[0090]实施例1的基础上，还包括下述步骤：除了优化后的TCRSingnalingPathway、[0093]保留的2个基因集后进一步筛选这2个基因集内的基因。与实施例1中的方法类似一个富集显著的数据集会得到一个leadingedgesubset，如果一个基因在其中的3个或3个以上leadingedgesubset中出现，那么就保留这个基因，如果在小于3个的leadingedgesubset中出现，那么则丢弃这个基因，最终得到经过优化后的Antimicrobials、[0097]收集扰动数据：LINCS数据库提供的大量小分子化合物的扰动数据做为药物筛选基因集：优化后的TCRSingnalingPathway、NaturalKillerCellCytotoxicity、[0099]实施例5所得到的筛选结果中存在有成百上千的目标候选药物，需要采取更进一疫检查点抑制剂联合用药的基因表达数据集包括肿瘤对照组与单用协同用药组、单用述的原始数据进行上游处理得到的基因表达矩阵数据，所述的基因表达矩阵数据可以为建模从GEO中收集的数据集的数据登录号为：GSE130324、GSE149825、GSE126988、[0102]将上述收集的免疫检查点抑制剂协同用药数据集的基因表达序列用GSEA富集的方法对实施例4筛选出来的6个特征基因集(需要将6个特征基因集进行同源基因转化成相1组vs空白对照组，联合协同用药组及anti_PD_1组vs单用anti_PD_1组；将GSEA富集结果NES>0且adjustp_value<0.05的GSEA结果中的NES值作为后续机器学习的正样本数据。用化合物的扰动数据(LINCS)对所有扰动数据(基因表达变化值)进行GSEA富集分析，将结果满足adjustp_value<0.05并同时满足NES<0的GESA结果的NES值作为负样本数据，用机器学习的方法对正负样本进行每一个核心基因集权重的计算，得出扰动评分：Y＝0.4986+[0110][1]RenrickAN,ThounaojamMC,AquinoM,etal.BortezomibSustainsTCellFunctionbyInducingmiR_155_MediatedDownregulationofSOCS1andSHIP1[0111]该文献中提到：Theseresultssupporttheapproachthatbortezomibcombinedwithotherimmunotherapieswouldleadtoimprovedclinicaloutcomesbyovercomingtumor_inducedexhau[0113]WrightonKH.Blockingendocytosisgivestherapeuticantibodiesaboost[J].NatureReviewsDrug[0115]HuiYC,LimaP,CruzJ,etal.EndocytosisInhibitioninHumanstoImproveResponsestoADCC_MediatingAntibodies[J].Cell,2020,180(5):895_914.e27.[0118]PeledM,AdamK,Mor[0119]上述文献证明，在MC38肿瘤细胞的小鼠模型中，与单独治疗相比，AZD_7762与[0123]AStudyofGalunisertib(LY2157299)inCombinationWithNivolumabinAdvancedRefractorySolidTumorsandinRecurrentorRefractoryNSCLC,or[0126]NishiiN,TachinamiH,KondoY,etal.SystemicadministrationofaTLR7agonistattenuatesregulatoryTcellsbydendriticcellmodificationandovercomesresistancetoPD_L1blockadetherapy[J].Oncotarget,2018,9(17):13301_13312.[0127]上述文献明确报道：Ourresultssuggesttlow_doseresiquimodisusefulasacompaniondrugtoPD_1/PD_L1blockadetherapy.[0129]KokolusKM,ZhangY,SivikJM,etal.Betablockerusecorrelateswithbetteroverallsurvivalinmetastaticmelanomapatientsandimprovestheefficacyofimmunotherapiesinmice[J].Oncoimmunology,2017:00_00.[0130]该文献明确报道：Treatmentwithpropranololaloneprovidedaminimal,althoughstatisticallysignificantdelayintumorgrowth.However,propranololadministrationsignificantlydelayedtumorgrowthwhencombinedwithαPD_1comparedtoeithermonotherapy.PropranololwithIL_2alsoproducedastatisticallysignificantdelayintumorgrowthcomparedtoIL_2alone,althoughthemagnitudeofimprovementwaslessthanobservedincombinationwithαPD_1.供的方法可以跳出现有的药物框架，从数以万计的化合物中相对精确地找到能增强ICB抗[0132]实施例7：药效实验以进一步证明实施例6中筛选得到的药物能增强ICB抗肿瘤效果方法发现新的药物，我们选择未报道联合免疫治疗增强作用的排在实施例6结果前列的三[0153]实施例7的结果表明实施例6筛选的3个药物均具备协同anti_其中Taltirelin增强anti_PD_1的效果最好，本实施例的在药效实验结束后进行了生存试鼠肿瘤组织去除后进行液氮速冻，然后放在_80℃冰箱进行保存，用干冰盒包裹后送样至6个特征基因集(C1_C4，M1_M2)筛选到的药物，接下来对BulkRNA_seq的测序结果进行分[0168]本实施例使用实施例1和实施例4筛选的特征基因集再次我们重点使用了LINCS2020的小分子化合物的扰动数据，并参考了LINCS一期和LINCS二期集(TCRsingnalingPathway、Natural