淀粉酶活力测定(1).ppt

1、淀粉酶活力的测定,助教：李岩李骊晴,CompanyLogo,淀粉酶活力的测定,CompanyLogo,背景知识综述,酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。单位：1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25，最适pH,最适底物浓度）下，每分钟内催化1微摩尔（mol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU=1mol/min。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。,CompanyLogo,背景知识综述,淀粉酶加水分解

2、淀粉的酶的总称。主要包括-淀粉酶、-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶。本实验主要测定-淀粉酶和-淀粉酶的活力。酶反应的影响因素温度、pH、底物浓度、酶浓度、激活剂与抑制剂,CompanyLogo,背景知识综述,温度：最适温度酶的热稳定性小麦淀粉酶最适温度为40pH：最适pH酶的pH稳定性小麦淀粉酶的最适pH为5.6,CompanyLogo,背景知识综述,底物浓度：P.S.髙浓度底物可能有抑制作用酶浓度：在一定的温度和pH条件下，当底物浓度足以使酶饱和的情况下，酶的浓度与酶促反应速度呈正比关系，酶浓度达到一定值后底物不足以使酶饱和,酶促反应速度与酶浓度不再成比例增加,CompanyLogo,背景知识

3、综述,激活剂&抑制剂酶的活性受某些物质的影响，能使酶活性增加的称为激活剂，能使酶活性降低的称为抑制剂。很少量的激活剂和抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性。例如氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。,激活剂,无机阳离子无机阴离子有机化合物,P.S.区别酶的激活和酶原的激活,抑制剂,可逆性抑制非可逆性抑制,竞争性抑制非竞争性抑制,CompanyLogo,背景知识综述,酶活力的测定方法：终止反应法：是在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热等方法使反应立即停止，然后用化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力

4、测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。本实验运用0.4%NaOH终止酶促反应。连续反应法：无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器（如紫外-可见分光光度计）等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。,CompanyLogo,实验目的,学习测定淀粉酶活力的原理和方法巩固并熟练分光光度计的使用,CompanyLogo,实验原理,淀粉酶广泛的存在于植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。-淀粉酶随机地作用于淀粉的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度降低，因此

5、又称为液化酶。-淀粉酶可以从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。,CompanyLogo,实验原理,-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在7015min钝化。根据它们这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热方法钝化-淀粉酶，测定-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶活力+-淀粉酶活力）减去-淀粉酶活力，就可求出-淀粉酶活力。-淀粉酶活力-淀粉酶活力,CompanyLogo,实验原理,淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解增加一单位还原端。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比

6、。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应式如下：,CompanyLogo,实验原理,用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）的量表示酶活力。标准曲线查出麦芽糖含量，计算结果。,CompanyLogo,实验原理,比色法：通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法选择适当的显色反应，研究最合适的反应条件和消除干扰的方法是比色分析的关键问题。溶液的酸度、显色剂的用量、温度、溶剂等对显色反应

7、都有影响。例：蒽酮比色法快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。,CompanyLogo,仪器、试剂、材料,实验仪器电子分析天平、容量瓶、滴管、漏斗、微量移液器（100-1000l、1.00-5.00ml）、具塞刻度试管（8）、试管（8大8小）、离心机、离心管、恒温水浴箱、水浴振荡器、紫外可见分光光度计、比色皿、恒温可调电加热炉试剂1%淀粉胶体溶液（1g淀粉，少量缓冲液溶解，滴入煮沸缓冲液中，冷却，定容100ml）0.4%NaOHpH5.6柠檬酸缓冲液（0.1M）,CompanyLogo,仪器、试剂、材料

8、,材料萌发三天的小麦粉末（将小麦处理后放置于冷冻干燥机中干燥若干天，然后用搅碎机打碎成粉末。）,3,5-二硝基水杨酸（1g溶于20ml1mol/LNaOH加入50ml蒸馏水，再加30g酒石酸钾钠，定容至100ml，塞紧瓶塞，防止C02进入）麦芽糖标准液（1mg/ml）,CompanyLogo,实验步骤,CompanyLogo,1、酶液提取,称取2g小麦粉末少量缓冲液溶解无损转入100ml容量瓶，缓冲液定容数分钟振荡一次，提取20min3000r/min，4，离心10min，转出清夜备用,CompanyLogo,2、-淀粉酶活力测定,准备测定糖,CompanyLogo,3、淀粉酶总活力测定,酶稀

9、释液制备：酶液5ml缓冲液稀释至100ml。,准备测定糖,CompanyLogo,4（1）麦芽糖的测定,标准曲线的制作,沸水浴5min，冷却后蒸馏水稀释至25ml，摇匀。,CompanyLogo,4（1）麦芽糖的测定,分光光度计520nm进行比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标，麦芽糖含量（mg）为横坐标，绘制标准曲线。,R=0.9960,CompanyLogo,4（2）麦芽糖的测定,样品的测定2、3步各管溶液2ml分别放入8只具塞刻度试管各加入2ml3,5-二硝基水杨酸试剂沸水浴5min，冷却后蒸馏水稀释至25ml，摇匀分光光度计520nm进行比色，记录吸光度从标准曲线查出麦芽糖含量，计算结果

10、,CompanyLogo,注意事项,稀释液用缓冲液配制。钝化-淀粉酶后应迅速用流水冷却。反应时间准确记录，同时水浴加热多个试管时可以间隔一段时间依次放入，保证实验组与对照组反应时间相同。,CompanyLogo,注意事项,精密取液使用微量移液器，注意微量移液器正确操作。具塞刻度试管沸水浴加热水蒸气易损坏贴纸标签，标签简明易辨识，圆珠笔写标签沸水加热时适时松动塞子，加热完毕冷却前及时拔开塞子通气，不要直接放入冷水中，试管易破损。,CompanyLogo,注意事项,沸水浴后一定要冷却至室温后用蒸馏水定容、摇匀再测量吸光度玻璃仪器易破损，小心使用，注意安全沸水浴温度高，取出试管时可带手套操作，小心烫伤,CompanyLogo,数据处理,标准曲线绘制：使用作图软件绘制麦芽糖标准曲线，如origin、Excel。做出曲线并进行线性拟合，得到标准方程,及相关系数R。-淀粉酶活力(mg麦芽糖/g鲜重5min)=淀粉酶总活力(mg麦芽糖/g鲜重5min)=,A-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖(mg)A0-淀粉酶的对