第十二讲 DNA文库的构建.ppt

1、基因组文库和cDNA文库的构建,第一节基因组文库的构建,1基因组文库(genomielibrary):将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。作用：获得特定基因。,2基因组文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库噬菌体文库黏粒文库人工染色体文库,3构建基因组文库应满足的条件3.1文库的完整性要包含基因组的完整序列信息，通过产生一系列一定大小、覆盖全基因组的DNA片段的重组克隆来实现。,限制性内切酶,克隆、转化、培养、鉴定,基因组DNA,基因组文库,3.2基因组信息的可重建性通过建立叠连群(contig)重建完整序列信息。,3.3文库的大小即文库中应包含的独立重组子

2、数。一般来说，DNA片段长，完整基因组文库所含的克隆数越少。反之，越多。基因组越大，文库应包含的克隆数越多，反之，越少。,4基因组文库的质量标准,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。,5基因组DNA文库构建的程序(噬菌体基因组文库的构建),基因组DNA的分离制备不同来源的DNA制备方法不同。一般来说，有液相法和固相法两种。液相法提取的DNA长度一般在100kb左右，基本可以

3、满足构建各种小插入片段基因组文库的要求。,大相对分子质量(highmolecularweight,HMW)基因组DNA的提取方法,基因组DNA的片段化酶切部分酶切的主要目的是产生随机性的DNA片段用于构建基因组文库。DNA分子的物理剪切DNA溶液的小孔喷射超声波处理高速搅拌,载体的制备要求：载体的去磷酸化处理载体的纯度,重组连接按照连接酶催化反应的最适条件设置反应体系，同时还应通过预备性实验确立反应体系具体的参数。,噬菌体离体包装重组噬菌体感染大肠杆菌,6基因组文库的扩增筛选文库的扩增基于噬菌体载体的基因组文库通过感染大肠杆菌，重组噬菌体在受体细胞中复制增殖并形成噬菌斑以实现增殖。风险：在进行

4、文库扩增时，很难保证重组分子均等增殖。所以造成有些克隆丢失，有的增加，有的减少。,文库的筛选噬菌斑原位杂交PCR文库筛选,基因组DNA文库,限制性内切酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,第二节cDNA文库构建,高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。,1概念cDNA文库：将生物特定的组织器官或特定时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。,2cDN

5、A文库优点cDNA克隆以mRNA为材料，特别适合某些病毒基因组结构研究及有关基因的克隆分离。cDNA文库的筛选比较简单易行。每一个cDNA克隆对应一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序列。可以在原核中表达。,3对cDNA文库质量评价3.1文库的代表性文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性。3.2重组cDNA片段的序列完整性。,4cDNA文库构建的步骤,分离mRNA；富集mRNA；cDNA的合成；黏性末端片段与载体的连接；离体包装获得重组噬菌体；检测重组噬菌体效价。,cD

6、NA文库的构建：,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,4.1细胞总RNA的提取和mRNA的分离,RNA：tRNA、rRNA、mRNA(1%5%）真核生物的mRNA具有一个polyA的3末端，可以被用于mRNA的分离；oligo(dT):polyA杂交链在高盐离子浓度下可以保持，在低盐离子浓度下或较高温度下就会分开，利用这一性质从RNA中分离纯化mRNA。,4.2cDNA第一链的合成,oligo(dT)引导的DNA合成法利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。,随机引物引导的cDNA

7、合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis)根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3-末端的oligo(dT)引物一处开始。,4.3第二链cDNA的合成,cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA:cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。cDNA第二链的合成的方法大致4种：自身引导合成法置换合成法引导合成法引物衔接头合成法,自身引导合成法获得的单链cDNA3端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆

8、菌聚合酶IKlenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。,置换合成法,以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。,RNaseH：特异水解与DNA杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生带有3OH和5P的产物,引导合成法,引物-衔接头法,5全长cDNA文库(fulllengthcDNAlibrary),导致cDNA不完整的原因：cDNA第二链合成中聚合酶的外切核酸酶活性mRNA的降解，它容易从5端降解。起始生物材料、抽提和纯化过程中RNase的污染、机械断

9、裂.反转录酶的合成特性与mRNA的分子结构有关与反转录酶从转录复合体上脱离有关,oligo(dG)引导合成全长dscDNA,载体引导合成全长dscDNA,置换法合成全长dscDNA,6基因组DNA文库与cDNA文库的比较,cDNA文库只包含某种生物体特定组织、特定发育阶段表达的基因(具有时空特异性)。基因组文库的出发材料是完整的生物基因组DNA，每一个基因都存在于完全的基因组文库中，并不受生物组织或发育时期的影响。,cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列，cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困