色谱概论.ppt

1、色谱分析概论(AnIntroductiontoChromatography),1、色谱法的产生和发展1906俄国植物学家Tswett分离叶绿素创立并命名。将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，用石油醚自上而下淋洗，形成一圈圈不同颜色的色带色谱法（chromatography）。,一、概述,碳酸钙粉末为固定相（stationaryphase）：在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。石油醚为流动相（mobilephase）：与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相发展：1931年，Kuhn等用同样的方法成功地分离了胡萝卜素和叶黄素，从此，色谱法开始为人们所重视，此后，相

2、继出现了各种色谱方法40年代纸色谱50年代薄层色谱1941年色谱塔板理论1952年气相色谱、1970s高效液相色谱,2、色谱分离原理,样品中某组分进入色谱柱内，将在固定相和流动相中达到一定的分配(cS/cM)。流动相总是以一定的速度流动，而固定相则固定不动。那么在流动相中的组分分子将以流动相流速u向前行进，而固定相中的组分分子则和固定相一起停留不动,组分进入色谱柱：固定相：ns流动相：nm,色谱柱中载气流动速度为U0，组分在流动相中的分数为R，则组分X在色谱柱中的平均运动速度UX为：,组分的平均运动速度：,组分在色谱柱上的流出时间：,内因：不同组分在固定相和流动相之间的分配系数K不相同。外因：

3、流动相与固定相之间的相对运动。定义：色谱又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配系数）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。色谱分离靠的是不同的分配系数物理分离方法。,色谱分离的原因,3、分类：按固定相的外形分类：柱色谱；平板色谱（薄层色谱；纸色谱）按流动相分：液相色谱LC气相色谱GC超临界流体色谱SFC（流动相超临界流体）,4、色谱法的特点优点：（1）分离效率高。复杂混合物，有机同系物、异构体。（2）灵敏度高。可以检测出10-6甚至10-9含量的物质。（3）分析速度快。一般在几分钟完成一个试样

4、中所有组分的分析。（4）应用范围广。气相色谱适用于沸点低于400的有机或无机试样的分析；液相色谱适用于高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足：被分离组分的定性较为困难。,色谱流出曲线：从流动相带着组分进入色谱柱起就用检测器检测流出柱后的组分，并用记录器记录信号随时间变化的曲线色谱流出曲线。待测组分在流出曲线上表现为峰状，叫色谱峰。,二、色谱基本术语,1）基线baseline仅有纯流动相通过色谱时的流出曲线。在稳定的条件下应是一条水平的直线。2）峰高（h）和峰面积色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。色谱峰与峰底基线所围成区域的面积叫峰面积。3）保留值a.死时间deadtime(tM)：不与固定相作

5、用的物质从进样到出现峰极大值时的时间。,b、保留时间retentiontimetR试样从进样到出现峰极大值时的时间。c、调整保留时间soluteretentiontimetR某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。保留时间一般可作为色谱定性依据。但常受流动相速度的影响。,d、相对保留值relativeretention2,1组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。,相对保留值只与柱温及固定相性质有关，是色谱中广泛使用的定性数据。,在多元混合物分析中，选择最难分离的物质对，它们的相对保留值称为选择性因子separationfactor（）1,e、分配比(容量因子

6、:capacityfactor)k组分在固定相和流动相中分配量之比,k与保留值、分配比、相对保留值、分配平衡常数（K）的关系：,h.区域宽度：是指色谱峰的宽窄程度。宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。区域宽度通常有三种表示方法：标准偏差：峰高0.607倍处峰宽处的一半。半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.354峰底宽W：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离。W=4,色谱流出曲线的意义：色谱峰数样品中单组份的最少个数；色谱保留值定性依据；色谱峰高或面积定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。,一）、塔板理论塔板理论是半

7、经验式的理论。塔板理论将色谱柱看作精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。,三、色谱分离理论,当塔板数大于50时，峰形就是对称的。在实际色谱柱中，n值很大（106109）。色谱峰一般为正态分布.,色谱柱的分离效果（柱效）塔板数和塔板高度,1.理论塔板数n有效塔板数：,2.理论塔板高度有效塔板高度：,塔板理论的特点：优点：(1)、提出评价柱效指标(2)、解释色谱流出曲线呈正态分布(3)、从热力学角度解释色谱分离过程缺点：(1)、色谱峰宽窄(2)、影响柱效的因素及提高柱效的途径。,二）速率理论范弟姆特方程式：vanDeemter方程：H=A+B/u+Cu式中：u：为流动相的线速度；A：涡流扩

8、散系数B：分子扩散项系数C：传质阻力项系数。,涡流扩散项(A)溶质分子受到固定相颗粒的阻碍，在流动过程中不断改变运动方向（“涡流”），使同一溶质的不同分子在通过填料的时间不一致，引起色谱峰的展宽,dp：平均直径：颗粒的不规则因子,减小A的方法：使用粒度细和颗粒均匀的填料，均匀填充。,2）分子扩散项(B)由于浓度梯度引起的谱线展宽。当样品被以点状注入色谱柱时，随着流动相流动，浓度变化。,是气体扩散路径弯曲的因素，也称弯曲因子，DG为组分在气相中的扩散系数(m2.s-1),减小B的方法：采用较高的载气流速，使用相对分子质量较大的载气，控制较低的柱温。,3）传质阻力项(C)传质：物质系统由于浓度不均

9、匀而发生的物质迁移过程。传质阻力：物质迁移过程的阻力。气相传质阻力：试样在气相和气液界面上的传质的阻力液相传质阻力：发生在气液界面和固定相之间的传质阻力,4）流速u由方程H=A+B/u+Cu知道：当u一定时，仅在A、B、C较小时，H较小，柱效较高；反之则柱效较低，色谱峰将展宽。,、其它,影响色谱峰宽窄因素除、和外，还与柱长和内径有关及柱外效应有关。色谱柱越长，色谱峰越窄。无限直径效应：内径足够大的色谱柱，使溶质分子在流出色谱柱之前不会到达管壁区。无限直径柱可克服管壁效应，从而提高柱效。柱外效应：指除色谱柱之外的引起色谱峰展宽的因素。,速率方程特点：1、解释色谱峰展宽因素2、影响板高因素3、从动

10、力学角度解释色谱分离过程对实际工作具有指导意义选择色谱分离条件（色谱柱填充的均匀程度、填料粒度、流动相的种类及流速、固定相的液膜厚度等）,分离度及色谱分离方程一、分离度(Resolution,R)定义：两峰保留时间差与两峰峰底宽平均值之商,tR1和tR2分别为峰1和峰2的保留时间；w1和w2分别为峰1和峰2在峰底（基线）的峰宽，即通过色谱峰的变曲点（拐点）所作三角形的底边长度,R1,有部分重叠，R=1能明显分开,R1.5两峰完全分离R可直接于色谱图计算,调节，n，k获得最佳分离条件1、选择因子的大小与两组分性质有关。=1不能分离，越接近1时需要增加柱长和延长分离时间。改变的方法：改变流动相或固

11、定组成；改变柱温；采用化学方法。,色谱分离方程式,2、Rn1/2。增加塔板数可以增加分离度。增加柱长但会延长分析时间。3、容量因子k取决于组分和色谱柱的性质。加大容量因子k可以增加分离度，但会延长分析时间。一般通过控制柱温或流动相的组成，使k在15之间。因此色谱分离条件的选择是一个综合因素，要考虑选择色谱柱的类型、流动相及分离对象的特点。,色谱定性和定量分析,一、色谱的定性分析色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。在相同条件下保留值作为一种定性指标。但保留值并非专属的。（一）利用纯物质对照定性（二）相对保留值法（三）加入已知物增加峰高法（四）双柱保留定性法,二、定量分析色谱定量的原理：

12、当操作条件一致时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比。mi=fiAimi：组分质量；Ai：组分峰面积；fi：组分校正因子。,（一）峰面积测量方法峰面积是色谱图提供的基本定量数据，峰面积测量的准确与否直接影响定量结果。对于不同峰形的色谱峰采用不同的测量方法。（1）对称形峰面积峰高乘以半峰宽A=1.065hW1/2（2）不对称形峰面积峰高乘平均峰宽A=1/2h（W0.15+W0.85）,（二）校正因子fi峰面积与组分的质量有关。mi=fiAifi非常数。校正因子分为绝对校正因子和相对校正因子。绝对校正因子：组分i质量与峰面积比fi=mi/Ai相对校正因子:组分i的相对校正因子fi

13、为组分i与标准物质s的绝对校正因子之比。fi=fi/fs,定量方法,1.归一化法把所有出峰组分的含量之和按100%计的定量方法。Pi%为被测组分i的百分含量；A1、A2An为组分1n的峰面积；f1、f2fn为组分1n的相对校正因子。特点：简单、准确，操作条件变化时对定量结果影响不大。但要求所有组分必须出峰。测量低含量尤其是微量杂质时，误差较大,例：某混合物中只含乙醇、正庚烷，苯和醋酸乙酯，色谱分析数据如下，计算各组分的相对含量。,解：乙醇%=（5.00.64）/（5.00.649.00.704.00.787.00.79）=17.6%正庚烷%=34.7%苯%=17.2%醋酸乙酯%=30.47%,

14、2.内标法当样品各组分不能全部流出，或有些组分在检测器上无信号，或只需对样品中某几个出现色谱峰的组分进行定量时可采用内标法。3.外标法外标法实际上就是常用的标准曲线法。绘制标准曲线。样品测定时，与绘制标准曲线完全相同的色谱条件下准确进样，根据所得的峰面积（或峰高），从曲线查出被测组分的含量。,例：两物质A和B在30cm长的色谱柱上的保留时间分别为16.4和17.63min，有一不与固定相作用的物质，其在此柱上的保留时间为1.30min。物质A和B的峰底宽分别为1.11和1.21min。试问：1）柱分辨率R；2）柱平均理论塔板数nav3）平均塔板高度Hav4）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？5）使用上述较长的柱进行分析时，其分析时间为多长？6）不增加柱长，要求在原来的分析时间内R达到1.5，该柱的塔板高度应为多少？,1）柱分辨率R,2）柱平均理论塔板数nav,3）平均塔板高度Hav,4）若要求R达到1.5，则柱长至少应为多少？因有,L2=60cm,5）使用60cm长的柱进行分析时