PFGE(脉冲场凝胶电泳)-标准操作规程(SOP)

1、PFGE（脉冲场凝胶电泳） 标准操作规程(SOP)关键词：PFGE，脉冲场凝胶电泳目的：运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型图谱分析：采用“PFGE脉冲场凝胶电泳分子分型识别系统”（官微：PFGE_CHINA）进行图谱分析。系统主要功能是PFGE图谱分子分型在线识别和处理，提供二叉层级聚树，MLVA、MLST字符类型的最小生成树，SEQUENCE基因片段类型的亲缘树计算和图形绘制，用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源以及有效控制疫情。第一天一、胶块的制备1、在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml细胞悬浊液（CSB）；2、在1.5ml epp

2、endorf管上标记好对应样品的名称；3、在模具上标记好对应样品的名称；4、用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，用bioMerieux Vitek colorimeter测其OD值，并调整至3.64.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。5、取400l细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。6、从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20l蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。7、制备好

3、1%Seakem Gold：1%SDS，放于56水浴箱中。8、在eppendorf管中加入400l的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。注意事项：（1）用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。（2）细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。（3）在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。（4）混合物加入模具时不能产生气泡。（5）在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56水浴箱中。二、细胞的裂解1、在50ml的screw-c

4、ap tube上做好标记。2、配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液加入25l蛋白酶 K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。注意：蛋白酶K要置于冰上，配制好的细胞CLB也要置于冰上。3、每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。（1）可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。（2）一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。5、保证胶块在液面下而不在管壁上。6、将管子放在54水浴摇床中孵育2小时

5、，转速约170转/分钟。7、将纯水和TE放在50水浴摇床中预热。三、洗胶块1、从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。注意：把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。2、每管中加入15ml预热的纯水。3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50水浴摇床中，摇10分钟。4、倒掉水，用纯水再洗一次。、5、倒掉水，加入15ml预热的TE，在50的水浴摇床中摇15分钟。6、倒掉TE，用TE重复洗三次，每次1015分钟。7、倒掉TE，加入10ml TE，放在4冰箱保存备用。注意：要确保胶块在液

6、面下而不在管壁或盖子上。四、胶块内DNA的酶切1、在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。2、按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。试剂l/胶块l /10胶块纯水180l1800lBuffer D20l200l总体积200l2000l注意：缓冲液要置于冰上。3、在每个1.5ml eppendorf管中加入200l缓冲液H的稀释液。4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。5、用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。7、将管子放在37水浴中孵

7、育10-15分钟。8、在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。试剂l/胶块l /10胶块纯水175l1750lBuffer D20l200l酶（10U/l）5l50l总体积200l2000l注意：（1）将酶置于冰上，用后立即放在20保存。（2）用枪头吸出缓冲液H，避免损伤胶块。9、每管加入200l混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。10、在37水浴中孵育至少2小时。五、加样（一）将胶块直接粘在梳子齿上1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。2、从37水浴中取出胶块，平衡到室温。3、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸

8、出胶块。4、每管加入200l 0.5TBE。5、把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。6、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。7、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在5560平衡的1SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。8、记录加样顺序。（二）将胶块直接加在加样孔内1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。用水平仪调整胶槽使其水平。2、把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml

9、熔化的在5560平衡的1SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。3、小心拔出梳子。4、从37水浴中取出胶块，平衡到室温。5、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。6、每块胶加入200l 0.5TBE平衡。7、用小铲将胶块加入加样孔。8、用溶化的胶封闭加样孔。注意：a)可以在加样孔中加入0.5TBE，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽量避免气泡形成。b)记录加样顺序。六、电泳1、确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。注意：不要触碰电极。2、加入2.2L 0.5TBE,关上盖子。3、打开主机和泵的开关，确保泵设在70（这时缓冲液的流速约1L/分钟）和缓

10、冲液在管道中正常循环。4、打开冷凝机，确保预设温度在14（缓冲液达到该温度通常需要20分钟左右）。5、打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。6、设置电泳参数。7、记录电泳初始电流（通常120145ma）。8、结束电泳：关机顺序为：冷凝机泵主机。第二天七、图像的获取1、取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml，1：10,000稀释，即在400ml水中加入40l储存液）。注意：EB是致畸剂。储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用3-5次。废弃的EB溶液应妥善处理。2、将托盘放在摇床上摇25-30分钟。3、放掉

11、电泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。4、戴上手套将用后的EB溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如果可能每20-30分钟换一次纯水。5、用Gel Doc 2000拍摄图像。注意：如果背景干扰分析，可进一步脱色30-60分钟。6、转换成*.1sc文件用于处理分析。八、数据的分析图像的读取电泳图像通常用BIO-RAD的GEL DOC 2000或其它成像系统来获取。其它可以替代的成像设备，只要具有CCD相机，可以提供IBM兼容的未压缩的TIFF图像，且分辨力768 x 640像素，能够用BioNumerics soft

12、ware (Applied Maths, Inc.)软件与PulseNet数据库中其它图像进行对比分析，也可以运用。运用GEL DOC 2000的简单说明：QUANTITY ONE软件1、点击QUANTITY ONE按钮打开该软件。2、点击菜单FILEGEL DOC。注意：需要1020秒打开窗口。3、打开抽屉，把胶放在台板上。胶已经经过EB或GEL-STAR染色并经过充分脱色。用黑色胶框把胶放在合适的位置。关上抽屉门。图像的获取1、按下EPI-LIGHT按钮打开白光。2、把胶放在调准网格线内，使胶的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对齐。3、保证调准网格线和过饱和按钮被选中。4、改变镜头的MI

13、DDLE RING以调整图像的大（顺时针）小（逆时针），使图像占据整个窗口。如果需要，挪动胶在台板上的位置。胶的加样孔、下边界和左右边界在屏幕上都应该可以看到。5、如果需要，按BOTTOM RING以调整相机的焦距。注意：焦距的调整只可以偶尔用之，不可用于每一块胶。可以用尺子帮助调整焦距。6、按下EPI-LIGHT关掉白光，按下UV按钮打开透射紫外光。7、点击AUTO EXPOSE以确定大概的曝光时间。当图像出现在窗口时，AUTO EXPOSE自动关闭而MANUAL EXPOSE被激活。8、点击MANUAL EXPOSE的按钮，调整曝光时间。而调整饱和度时，点击箭头或TURN THE TOP

14、RING以降低光量（如果图像过饱和，图像显现红色）。注意：如果出现对话框“曝光可以在0.03360秒之间波动”，则需通过改变相机的像素以调整饱和度。调整饱和度使样品条带没有红色很重要，因为这会影响BIONUMERICS软件对胶图像的分析。而胶加样孔的过饱和属于正常现象。9、当图像调整的比较满意时，按下FREEZE按钮停止曝光过程。按下UV按钮关掉紫外光（如果开门时UV灯打开，它会自动关闭）。图像的输出1、保存图像（*.1sc）：FILESAVE。确保选择正确的路径。文件默认的名字包括日期、时间和用户。可以改变文件名。2、打印文件：FILEPRINTVIDEO PRINT，也可以直接点击屏幕上的

15、PRINT按钮。3、转为*.TIFF格式：FILEEXPORT TO TIFF IMAGEEXPORT，选择正确的路径。4、关闭QUANTITY ONE程序：FILEEXIT。5、取出胶放在染色盒内。用软麻布擦掉台板表面多余的液体，用水或70的异丙醇洗干净。试剂储存液的配制1、1 M TrisHCl, pH 8.0*121.1 g Tris base溶于650-700 ml纯水中，加入80 ml 6 N HCl*，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000 ml，高压灭菌。或者157.6 g Tris-HCl溶于800 ml纯水中，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000 ml，高压灭菌

16、。2、10 N NaOH*400 g NaOH小心溶于800 ml纯水中，冷却到室温，加灭菌的纯水使终体积至1000 ml。3、0.5 M EDTA, pH 8.0*18 6.1 g Na2EDTA2H2O溶于800 ml纯水中，加入50ml 10N NaOH调pH至8.0，加水终体积至1000 ml，分成数份，高压灭菌。4、20% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)*十二烷基硫酸钠用于E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, PFGE将20克SDS小心加入装有80 ml灭菌纯水的容器中，在35- 45C轻轻混匀溶解

17、，定容至100ml。5、20 mg/ml 蛋白酶K储存液*100 mg Proteinase K 粉末溶于5 ml 灭菌纯水中，混匀，分装在1.5 ml离心管中，每管500-600 l，-20C保存备用。6、10X Tris-Borate EDTA Buffer (TBE), pH .8.3*0.9 M Tris base (108 g)0.9 M Boric Acid (55 g)0.02 M EDTA, pH 8.0 (40 ml 0.5 M)溶于1000 ml灭菌的纯水中，高压灭菌注意：如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。7、Ethidium Bromide（EB）*10 mg/ml EB的储

18、存液用纯水1:10,000 稀释(即100 ml水中加入10 l储存液)，（500ml水中加50ul）。稀释液在丢弃前可以染5-6块胶。实验试剂注意：用灭菌的玻璃制品、塑料制品和纯水来制备以下试剂。1、Tris:EDTA Buffer (TE), pH 8.0*（10 mM Tris-HCL:1 mM EDTA , pH 8.0）10 ml 1 M Tris-HCL, pH 8.02 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0用灭菌的纯水稀释到1000 ml在E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, and Campylobacter j

19、ejuni PFGE 用TE Buffer 于:. 溶解1% SeaKem Gold:1% SDS agarose. 细菌裂解后洗胶块在L. monocytogenes PFGE 用TE Buffer于:.悬浮菌细胞. 细菌裂解后洗胶块2、Cell Suspension Buffer (CS100 mM Tris-HCl:100 mM EDTA, pH 8.0用于E. coli O157:H7, Salmonella, and Shigella sonnei PFGE10 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.020 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0用灭菌的纯水稀释到100 m

20、l3、Cell Lysis Buffer（CLB）50 mM Tris-HCl:50 mM EDTA, pH 8.0 + 1% N-Lauroyl-Sarcosine, Sodium salt (Sarcosyl)，0.1mg/ml Proteinase K (用前再加入)用于裂解E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei,和 Campylobacter jejuni25 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.050 ml 0.5 M EDTA, pH 8.050 ml 10% Sarcosyl 3用灭菌的纯水稀释到500 ml，每5 ml

21、CLB加入25l蛋白酶K储存液(20 mg/ml)，使其终浓度为0.1 mg/ml.5、0.5X TBE Buffer200 ml 5X TBE用纯水稀释到2000 ml或100 ml 10X TBE用纯水稀释到2000 ml注意：用来稀释5X TBE、10X TBE的纯水可以不灭菌。6、SeaKem Gold Agarose做胶块； 电泳胶报价 seakem gold 琼脂糖 25g 货号50111，1567元人民币。可打9折。125g 货号 50150 ，BMA， 6422元。北京基因公司 10-；上海 021-；广州 020-；020-天津 022；西安 029-；成都 028-；沈阳

22、024-济南 0531-；武汉 027-；昆明 0871-；杭州 0571-长沙 0731-；重庆 023-；南京 025-7、无菌的超纯水8、蛋白酶K粉末或蛋白酶K溶液（20mg/ml）6、限制性内切酶E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonneiXbaI,，AvrII (同切限制内切酶BlnI)，SpeI(NotI可用于S. sonnei；但不用于E. coli O157:H7)L. monocytogenes，AscI, ApaICampylobacter jejuni, C. coli，SmaI, KpnI器 材1、Dade Microscan

23、 Turbidity MeterSpectrophotometerbioMrieux Vitek Colorimeter调整细胞悬浊液的浓度2、微波炉溶胶3、水浴摇床裂解胶块中的细胞(54C)用水和TE(50C)洗胶块4、56C水浴箱平衡和保温熔化的胶5、25C, 30C, 37C水浴箱酶切6、50C水浴箱加热用于洗胶块的水和TE，酶切7、离心机。8、最少需要两个水浴箱一个平衡到56C，另一个到37C。如果需要，温度可以上下调动。Listeria PFGE中胶块的ApaI酶切需30C水浴。耗 材1、无菌的Falcon 2054（12-mm x 75-mm）或Falcon 2057（17-mm

24、x 100-mm）用于细胞悬浊液的制备基因公司代理 ，2、无菌的聚酯纤维或棉签用于从琼脂平板上刮取细菌3、无菌的枪头或巴斯得吸管4、无菌的1.5 ml离心管用于混合细胞悬浊液和胶、酶切5、无菌的50 ml screw-cap tubes 或50 ml Oak Ridge tubes 用于装胶块，6、Green Screened Caps（Bio-Rad ）洗胶块时用伯乐公司 货号 170-3711。7、模具10孔（可重复利用的，2cm x 1cm x 1.5mm）50孔（一次性的，1.5mm x 10mm x 5mm)8、单刃剃须刀、手术刀、平皿或类似物用于切胶块9、无菌的一次性皮氏平皿或大的

25、玻璃载物片用于切胶块10、一端宽、一端窄的平铲药铲，生工等公司的实验室耗材部分有。11、标准胶槽（14 x 13cm的框和平板）12、10孔的梳子（14 cm长，1.5 mm宽）13、15孔的梳子（21 cm长，1.5 mm宽）Bio-Rad 170-362714、胶水平台15、盛放EB染液的塑料容器16、70异丙醇、5%10%的漂白剂或其它合适的消毒剂17、各种体积的无菌烧瓶或瓶子（50 ml - 2000 ml）18、各种规格的无菌量筒（100 ml - 2000 ml）19、无菌的吸管（2 ml - 50 ml）20、保护性手套（无石化粉的乳胶手套、聚乙烯手套或腈类手套）21、防热性手套

26、22、冰盒名称：免疫组化 标准操作规程(SOP)关键词：免疫组化目的：规范免疫组化操作主要步骤:1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60恒温箱中烘烤20分钟。1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。1）抗原热修复（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修