rtqPCR实验操作PPT课件

1、荧光实时定量PCR rt-qPCR，实时荧光定量PCR(rt-qPCR)定义：在PCR反应系统中添加荧光组，利用荧光信号的变化实时监控PCR过程，对初始模板进行定量分析。3，Rt-qPCR的应用，mRNA表达的研究用耐肿瘤基因表达检测病毒感染的定量监测。4，PCR的基本原理，试管中的DNA复制反应，1 .根据DNA半保存复制的机制2 .体外DNA分子通过人工控制不同温度下的可变性和复性的特性1 .双股DNA，单股2。单链DNA和合成底漆退火3。DNA聚合酶沿着单链模板将引物延伸到双链DNA。5，基本阶段变质：加热退火，使双链DNA成为单链(94，30s):冷却使底漆和互补模板在本地形成混合链(

2、55，30s):耐热DNA聚合酶为5-3 ，6，图表，7，Real-time定量PCR分析器将荧光组添加到PCR反应系统中，利用荧光信号累计实时监测和持续分析整个PCR过程，同时，随着反应时间的推移，将监测到的荧光信号的变化绘制成一条曲线，最后通过标准曲线定量分析未知模板。8，SYBR Green，SYBR Green可以与双链DNA的小沟部分结合，只有与双链DNA结合才能释放荧光，DNA双链分离后不会释放荧光，随着PCR循环数的增加，产物量增加，产生的荧光信号逐渐增加，实现了荧光信号和产物量的相关性。9，理论上，PCR反应过程中产生的DNA产物呈指数增长。换句话说，每增加一个周期，PCR产物

3、就会增加一倍。但是随着反应周期数的增加，产物积累和原料消耗，PCR反应最终不能保持指数方式的扩大，进入线性期间和平台。在整个PCR反应过程中，PCR产品的数量与仅在指数期间添加的初始模板数量有明显的数学关系(PCR产品数量=初始模板数量2 n，N=循环数量)，因此使用公式可以准确计算产品数量中的初始模板数量。在线和平台持续时间、PCR产品数量和初始模板数量之间没有精确的数学关系，初始模板的数量由两个持续时间的产品数量计算得不准确。10，在相同条件下，通过复制放大，每个放大周期，测试荧光检测每个孔的目标基因片段的含量，记录每个反应管的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数(样本的域值循环数Ct)

4、，意味着目标基因在原始样本中越少，即初始模板的数量越少。11，logX=n (1 E) logX0，12，实验阶段，1，利用正在测试的RNA作为cDNA，确定要运行的基因和要使用的内部参考序列，板块排列顺序。2，DNA样品制备，水，sybr，前后引物，融化，离心力。3、样品混合物(每个孔为sybr10ul，cDNA30ug，水为8.4ul-cDNA)，计算前后底漆数量(每个孔和前后底漆各为0.8ul)，并进一步计算1至2个孔。比例混合样本，sybr，水。把前后底漆按比例混合。4、按样品混合物的销售顺序，每孔18.4微升，加后适当的前后底漆混合物，每孔1.6微升。5、薄膜、离心、机械、实时PCR扩增后输出对照组和试验对象基因及内部参考基因CT值。实验组的基因表达是与对照组相比向上或向下调节的倍数。，14，荧光定量PCR减少错误的方法，1，校准生物错误：内部参数(保姆基因)2，随机错误减少，15，1，校准生物错误内部参数(保姆基因)、内部参数基因(Endogenous Control)对校准实验中样品本身对定量结果的影响：核酸提取时一般以重量、体积或细胞数为单位提取样品，提取过程中存在