细胞培养与常用病毒学技术课件

1、细胞培养与常用病毒学技术,第05章 细胞培养与常用病毒学技术,本章主要内容： 1. 动物细胞培养技术 2. 病毒及其培养技术 3. 病毒效价（滴度）测定技术 4. 常用分子病毒学技术,细胞培养与常用病毒学技术,第1节 动物细胞培养技术,一、几个概念,1.原代细胞：直接由组织制备的细胞培养物。未经建系，不能 无限传代，仅可传有限代次，一般58代。 2.传代细胞：能够无限传代繁殖的细胞群，不具有来源组织的 核型和贴壁细胞依赖性。 3.鸡胚：孵化至911天的健康或SPF鸡胚。 4.基础培养基（minimum essential medium, MEM）：能够满 足动物细胞生长发育的基本营养需要的培养

2、基。,细胞培养与常用病毒学技术,5.生长液：含10%FBS和1%双抗的DMEM培养液。 6.维持液：含2%FBS和1%双抗的DMEM培养液。 7.消化（分散）液：0.25%胰酶。配方入下： NaCl 0.8g KCl 0.2g Na2HPO4 12H2O 0.29g KH2PO4 0.02g EDTA 0.03g 胰酶 0.25g 水至 100mL 8.接毒：将毒种按一定比例加入细胞培养物中，以进一步增 殖病毒的过程。方法分为单层接种和同步接毒。,细胞培养与常用病毒学技术,二、细胞培养步骤,1.细胞的复苏 从液氮中取出冻存的细胞，迅速投入37水浴中，待完全融化后，直接转入盛有5-10mL细胞生

3、长液的60mm细胞培养瓶中，在37、5CO2培养，待细胞贴壁后，换生长液培养。 2.细胞的传代 移去细胞瓶中生长液，用PBS洗两次，用0.25%的胰酶消化液分散细胞，视细胞消化程度确定消化时间，一般在2-5min。待部分细胞出现脱落后，轻轻拍打细胞瓶，使细胞脱离瓶壁。加入生长液，用吸管吹打数次使细胞彼此分开，传代于2-3个与原培养瓶同样大小的培养瓶中，在37、5CO2培养。,细胞培养与常用病毒学技术,3.换液与维持培养 待传代后的细胞生长至80%满度时(一般应24hrs)，将生长液换掉，加入同样数量的维持液，继续培养。通常可维持23天。待细胞长满并开始出现衰老死亡者时，重复传代、换液的操作。

4、4.细胞冻存 待细胞长满后，也可将细胞保存起来。保存在-80或液氮中。具体操作如下：用消化液将细胞分散后，加入含10% DMSO（二甲基亚砜）的FBS营养液，使细胞浓度达106-107/ml，分装于细胞冻存管中，1ml/管。按照4、1hr，-20、4hrs、-80过夜的顺序冻存，最后置液氮中长期保存。 应注意：冻存过程应缓慢，而复苏过程应迅速。,细胞培养与常用病毒学技术,第2节 病毒及其培养技术,病毒：属于微生物界，是细胞内专性寄生的最小生命形态-微生物，即在自然情况下，它只能在活的细胞内才能复制和增殖。 细胞外的病毒，没有新陈代谢，不表现生命活性。但当其进入宿主细胞后，病毒核酸迅即启动和复制

5、，最后产生数量增多的子代病毒；病毒具有遗传性和变异性。 因此，病毒具有生命活动型和生命静止型的双重存在形式。与其他微生物不同，病毒有其自身的特性。,细胞培养与常用病毒学技术,一、病毒的特征,1. 病毒一般只含有一种核酸DNA或RNA，而其他微生物，包括细菌、支原体、立克次氏体和衣原体，则都同时含有两种核酸； 2. 病毒通过基因组复制和表达，产生子代病毒的核酸和蛋白，随后装配成完整的病毒粒子；而在其他微生物，则是核酸和许多其他组成成分一起参与生长、增殖过程，并常以二分裂或类似的方式进行； 3. 病毒缺乏完整的酶系统，不具备其他生物“产能”所需的遗传信息，因此必须利用宿主细胞的酶类和产能机构，并借

6、助宿主细胞的生物合成机构复制其核酸以及合成由其核酸编码的蛋白，乃至直接利用细胞成分。可以这样认为，病毒的生物合成实质上是病毒遗传信息控制下的细胞生物合成过程；,细胞培养与常用病毒学技术,4. 某些RNA病毒(反转录病毒)的RNA经反转录合成互补DNA (cDNA)，与细胞基因组整合，并随细胞DNA的复制而增殖，这就是所谓的DNA前病毒。 5. 病毒没有细胞壁，也不进行蛋白质、糖和脂类的代谢活动，因此对抗生素具有明显的抵抗力。 6. 病毒基因组形式多样：dsDNA、ssDNA、dsRNA、+ssRNA、-ssRNA等。既有线状，又有环状，还有分节段的。 细胞是组成动物、植物、微生物等生物体的基本

7、单位，但病毒与此不同，一个简单的病毒由蛋白质衣壳和核酸组成，复杂一些的病毒仅在衣壳外面多一层囊膜，故病毒可被称为亚细胞生物或分子生物。 病毒没有生长，也不以二等分裂方式繁殖，而是以某种方式将基因组释放到细胞内，一方面以其为模板转录mRNA合成蛋白，另一方面合成子代核酸，再组装为子代病毒粒子，最后释放到细胞外，这一过程叫增殖。,细胞培养与常用病毒学技术,复制：病毒的增殖：Replication、Multiplication。病毒以其核酸侵入易感细胞内，在病毒核酸信号指挥下，利用宿主细胞，按其自身为模板合成病毒的蛋白质、核酸及其它部件，然后装配成新的病毒粒子，最后释放到细胞外，开始另一个感染周期。

8、,复制周期(Replication cycle)：即感染循环(infection cycle)。从病毒吸附于宿主细胞开始，到子代病毒从细胞释放出来为止的全过程，称为病毒的复制周期。,二、病毒复制周期,细胞培养与常用病毒学技术,1.吸附和侵入 病毒吸附分两步进行，即可逆的非特异性吸附和不可逆的特异性吸附。首先，非特异性吸附即病毒与细胞以静电引力相结合。这种吸附可发生在细胞表面任何部位且易被冲洗、高浓度盐类和一定的pH环境所破坏，使病毒从吸附物上重新解脱出来。 随后是病毒的特异性吸附，即病毒蛋白(抗受体)与细胞膜上的受体特异性结合。这种吸附是不可逆的。病毒吸附细胞的过程，可在几分钟到几十分钟的时间

9、内完成。,病毒感染增殖的一般过程： 动物病毒的增殖过程大致可以分为：吸附与侵入、脱壳、病毒成分的合成以及装配与释放等4个主要阶段。,细胞培养与常用病毒学技术,细胞受体主要是胞膜上的糖蛋白。据估计，一个宿主细胞上的特异性受体部位可达104105个。但不一定每个细胞表面都有特定病毒的特异受体。细胞有无特定病毒的受体，直接影响是否对该病毒具有易感性。所以，病毒受体的研究是研究病毒感染的分子机制的重要内容之一。 侵入与吸附是一个连续过程。不过，侵入是一个依靠能量的过程。目前发现病毒侵入细胞有3种方式：病毒直接转入胞浆，如小RNA病毒；细胞吞饮病毒，如多瘤病毒；病毒囊膜同细胞膜融合，如流感病毒。无囊膜病

10、毒以前二种方式侵入，有囊膜病毒常以第三种方式进入。,细胞培养与常用病毒学技术,2.脱壳 病毒脱壳，包括脱囊膜和脱衣壳两个过程。有囊膜病毒(除痘病毒外)的脱囊膜过程就是上述侵入的过程。无囊膜病毒则只有脱衣壳的过程。 病毒核衣壳的脱落和核酸的逸出主要发生在细胞浆内。但不同病毒脱壳发生的地点和过程不完全一样。如呼肠孤病毒，并不发生完全的脱壳。某些在细胞核内增殖的DNA病毒，例如乳多空病毒、腺病毒和疱疹病毒，其核衣壳可能在未被完全脱壳的情况下就进入细胞核内。口蹄疫病毒则可能就在细胞膜上脱掉衣壳，病毒核酸直接进入细胞内。 脱壳必须有酶的参与，脱壳酶来自宿主细胞，有的为病毒基因编码。迄今，病毒侵入细胞并脱

11、壳的详细分子机制尚未完全研究清楚。,细胞培养与常用病毒学技术,3.病毒成分的合成 病毒侵入细胞并脱壳后，在其遗传信息的控制下，一方面病毒利用自身的特异性核酸聚合酶或反转录酶等进行病毒成分的合成；另一方面利用细胞生物合成的场所和原材料合成病毒的各种组成成份及其所需的酶类，包括病毒核酸转录或复制时所需的聚合酶；最后是由新合成的病毒成分装配成完整的病毒粒子。,细胞培养与常用病毒学技术,4.装配和释放 新合成的病毒核酸和病毒蛋白在感染细胞内逐步成熟。所谓成熟，是指核酸进一步被修饰，病毒蛋白亚单位以最佳物理方式形成衣壳。 例如脊髓灰质炎病毒的RNA必须同一个基因蛋白(VPg)结合后，才能成为病毒RNA。

12、与此同时，衣壳蛋白VP0、VP1和VP3形成5S的结构单位，再由60个5S形成80S的衣壳。病毒RNA进入衣壳，就形成完整病毒粒子，这就是装配。 病毒的装配效率甚低，常因核酸不能与衣壳有机地结合，形成缺乏感染性的空壳病毒（假病毒）。同样，病毒成分在细胞内装配成完整病毒粒子的详细分子机制尚不清楚。,细胞培养与常用病毒学技术,由于细胞的生物合成被病毒阻断，细胞发生变性及死亡（CPE），细胞自身的溶解就将病毒释放出来。某些不产生明显细胞病变的病毒的释放方式，目前还不十分清楚。相反，小RNA病毒合成速度极快，病毒粒子在胞浆内大量积聚，也许在细胞死亡之前，就可胀破细胞，释放病毒。 有囊膜病毒的释放过程就

13、是病毒核衣壳获得囊膜的过程。反转录病毒、披膜病毒、副粘病毒等，由于在胞浆内复制及装配，病毒在胞浆膜上获得囊膜。而疱疹病毒由于在胞核内复制及装配，病毒在核膜上获得囊膜。,细胞培养与常用病毒学技术,VIRAL LIFE CYCLE,ATTACHMENT,PENETRATION,HOST FUNCTIONS,ASSEMBLY (MATURATION),Transcription,REPLICATION,RELEASE,UNCOATING,Translation,MULTIPLICATION,病毒的复制过程,细胞培养与常用病毒学技术,（一）用细胞培养病毒,三、病毒的培养技术,病毒可用细胞、鸡胚和动物进

14、行培养。,细胞培养：cell culture. 用机械的方法(剪碎)或化学的方法(胰酶)，使动物组织或传代细胞分散成单个细胞悬液后，给以相应的营养和温度等条件，在体外进行培养。 包括原代培养、继代培养和细胞系（cell line）培养。 细胞培养技术是研究病毒的分子感染机制、生物大分子装配机制的重要手段，也是大量增殖病毒，制备细胞培养疫苗的基础技术。,细胞培养与常用病毒学技术,体外培养的细胞有两种基本形态,成纤维样细胞,上皮样细胞,1.细胞培养的类型,细胞培养与常用病毒学技术,鸡胚成纤维细胞 CEF：Chicken embryo fibroblast,1)原代细胞 由新鲜的、分化程度较低的组织

15、或胚胎，经剪碎并用胰酶消化后制备的细胞。,细胞培养与常用病毒学技术,地鼠肾细胞株 BHK21,非洲绿猴肾细胞 Vero细胞,2)细胞株（cell strain） 从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。,细胞培养与常用病毒学技术,人结肠癌上皮细胞Caco-2细胞,人子宫颈癌细胞HeLa细胞系,3)细胞系(cell line) 从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖。,细胞的传代：扩大培养用胰酶将长成致密单层的细胞(原代细胞、二倍体细胞株、细胞系)从一个培养瓶消化下来，并分装为23瓶，补充培养基后继续培养的过程。原代细胞的传代过程常称之为

16、继代。,细胞培养与常用病毒学技术,3. 单细胞制备方法,机械分散法：用于原代细胞的制备，如鸡胚成纤维细胞。 用剪刀将鸡胚剪成1mm3小块，放入底部有一块微孔铜丝网的10-20ml注射器内，将组织细胞挤过网孔，即可得到分散的细胞或配合酶消化法。,胰酶消化法：用于消化细胞间的蛋白成分。视不同组织和细胞，胰酶浓度和消化时间有所不同；一般为0.25%，在室温或37下作用一段时间胰酶消化后，再用吸管进行吹打，使之分散为单细胞。,螯合剂分散法：EDTA(乙二胺四乙酸二钠)可与钙镁离子结合，从而使上皮细胞类细胞分散，单独使用时消化效果可能不佳，与胰酶配制在一起，消化效果更佳。配制EDTA液时，需用无钙镁缓冲

17、液。,细胞培养与常用病毒学技术,4. 细胞培养的方法,1)原代细胞的制备：鸡胚成纤维细胞。取911日龄鸡胚，去头、四肢、内脏，PBS洗涤；置于小烧杯中，用剪刀剪碎(1mm3)。用0.25%胰酶消化：37、30min，吸弃胰酶，在组织块中加入培养液，用吸管轻轻吹打，使细胞分散，用纱布过滤，计数细胞悬液中的细胞数。,细胞计数：白细胞计数板。在白细胞计数板上放上盖玻片 取少量细胞悬液进行适当稀释，取一滴滴入白细胞计数板，使其渗入盖玻片下，计数五个大方格内的细胞总数： 细胞数/ml(五个大方格中的细胞总个数5)10000稀释倍数 将原始细胞悬液稀释至5105个细胞/ml后，装瓶培养。,细胞培养与常用病

18、毒学技术,9-10日 龄鸡胚,幼龄动 物组织,加培养基吹打分散 过滤、补足培养基,细胞培养与常用病毒学技术,25ml培养瓶装3ml，100ml培养瓶装10ml， 平放于37温箱培养,细胞培养与常用病毒学技术,37培养2448h，鸡胚成纤维细胞可形成致密单层，但细胞瓶中需装合适的细胞量。,细胞培养与常用病毒学技术,2) 细胞的传代,1）取生长良好的细胞； 2）倒掉培养液； 3）用PBS洗细胞面12次（可略去！）； 4）加入适量0.25%胰酶消化液使其覆盖细胞面； 5）室温下消化(时间视不同细胞而定)； 6）去胰酶，加入少量生长液，吹打分散细胞； 7）加入足量生长液，分装为约24瓶，温箱培养。,细

19、胞培养与常用病毒学技术,5. 影响细胞的因素,静置培养、转瓶培养、悬浮培养、微载体培养、中空纤维细胞培养和微囊化培养。,静置培养,将细胞悬液接入转瓶(塑料或玻璃瓶)，放于恒温箱的转鼓上进行培养。细胞仍是贴壁生长，但能增加供细胞贴壁的表面积，便于扩大产量；温和转动(68r/h)时，细胞有一段时间离开培养基，悬浮于空中，增加了气体交换，有利细胞生长。,转瓶,转瓶机,细胞培养与常用病毒学技术,6. 病毒增殖的技术,1.培养基：Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM。 2.血清：生长液加10%，维持液加2%。 3.pH：用碳酸氢钠调至中性偏碱，培养液呈粉红色。 4.温度：37。 5.细胞

20、接种量：合适，一般为105/ml。 6.消化：适度。 7.污染：严格无菌操作。原材料、培养基和试剂的消毒和 除菌、器材的消毒、操作，培养基需加双抗。,细胞培养与常用病毒学技术,试剂的配制：,1. 双抗：用灭菌三蒸水溶解青、链霉素，每毫升含青霉素104 IU、链霉素104ug，冷冻保存，使用时，100ml培养基加1ml。 2. 培养液和胰酶均可配制成较高浓度的液体存放于冰箱，前者 4，后者冷冻。 3. 配制培养基使用液时，加双抗和小牛血清后，再用碳酸氢钠 溶液调pH，不必按照培养基的使用说明，在溶解培养基粉剂 后立即加入碳酸氢钠。 注意：若要检查配制好的培养基是否无菌，可取少量装瓶，置于37温箱

21、。 为保持培养基无菌，可分装成较小的瓶子，每瓶一次用完冰箱保存的培养基较凉，使用前，可将培养基在室温下适当放置。,细胞培养与常用病毒学技术,病毒接种与收获：,1.取生长良好的敏感细胞，倒掉培养基，用PBS或Hanks 液洗涤细胞面12次。 2.加入预先稀释的病毒液，其体积为维持液的1%2%，轻晃 使其覆盖细胞面。 3.37静置如3060min，使病毒吸附于细胞表面。 4.加入维持液，37培养，每日镜检，多数病毒在接种后3 7d可使细胞出现病变(CPE)。 5.在CPE达80%左右时可收毒，冻融3次使病毒释放，离心去 细胞碎片，取上清液低温冷冻保存。,细胞培养与常用病毒学技术,同步接种和异步接种

22、：,1. 细胞长好后，再接种病毒，为异步接种法 2. 某些病毒(如细小病毒)需采用同步接种，才能更好地繁殖，即，在单细胞悬液分装后或分装后4h内，同时接种病毒。 3. 合适的病毒吸附时间和收毒时间可参阅相关文献。 4. 不产生CPE的病毒，可使用一些间接的指标，如免疫学方法 病毒毒价的测定：TCID50、空斑试验。,细胞培养与常用病毒学技术,选择敏感细胞：获得高滴度的病毒液,若用细胞繁殖病毒，针对不同病毒，需选择其相应的敏感细胞； 鸭瘟病毒可用鸡鸭鹅胚成纤维细胞； 马立克氏病病毒可用鸡胚和鸭胚成纤维细胞； 口蹄疫病毒可用BHK21、PK15等； 未知病毒，通过研究确定敏感细胞。,细胞培养与常用

23、病毒学技术,影响病毒繁殖的因素:,血清：接种病毒后，需使用维持液，即培养基中的血清含量减至2%；若血清影响到病毒繁殖，可用无血清培养基。 温度：37，某些病毒的最适温度或高于或低于37，如狂犬病病毒的最适温度为32。 pH：细胞生长时可产酸，虽然受病毒感染影响，细胞产酸能力下降，但由于大多数病毒的繁殖需要37d，故维持液中酸性物质仍可蓄积，配制维持液时可偏碱。 病毒接种量：适当稀释后，体积为维持液的1%10%。,细胞培养与常用病毒学技术,复习思考题,1. 概念：细胞培养、原代细胞、细胞株、细胞系、细胞 的传代、静置培养、转瓶培养。 2. 用细胞培养繁殖病毒时，有哪些因素可影响到病毒的 增殖？

24、3. 细胞培养有哪些方式？,细胞培养与常用病毒学技术,禽胚：鸡、鸭、鹅胚。许多病毒适合于禽胚繁殖；禽胚来源充足；操作简单。,（二）用禽胚培养病毒,目的：适于对禽胚敏感的动物病毒的分离、培养； 病毒滴度的测定； 中和试验：病毒的鉴定、分型、抗体检测； 抗原制备； 广泛用于生物制品的研究和生产。,细胞培养与常用病毒学技术,1.禽胚的选择,根据不同病毒选择不同禽胚： 鸡胚：禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、禽痘病毒。 鸭胚：狂犬病病毒、减蛋综合征病毒。 鹅胚或番鸭胚：鹅细小病毒(小鹅瘟)、番鸭呼肠孤病毒。,细胞培养与常用病毒学技术,大头朝上：蛋壳、壳膜与气室,2. 鸡

25、胚的结构,细胞培养与常用病毒学技术,撕开壳膜，露出绒毛尿囊膜,壳膜,尿囊膜,细胞培养与常用病毒学技术,9日龄鸡胚结构：,细胞培养与常用病毒学技术,3.准备鸡胚与毒种,鸡胚孵化：3738、相对湿度为53%57%的条件下孵化，孵育3日后，每日翻蛋12次。 孵至第4日，用照蛋器观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动；随后每日观察一次，将胚动呆滞或不动、血管昏暗模糊者，随时淘汰。 生长良好的鸡胚孵育至接种前。,准备毒种：将病毒毒种用灭菌生理盐水进行适当稀释分离病毒时，用适量生理盐水加入病料中研磨、加抗菌素抑菌、离心取上清、经无

26、菌检验后用于接种。,细胞培养与常用病毒学技术,1）尿囊腔接种：选910日龄鸡胚。新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感病毒等。 2）绒毛尿囊膜接种 3）卵黄囊接种 4）羊膜腔接种 5）脑内接种 6）胚体接种 7）静脉接种,4.接种,根据不同病毒选择不同途径：,细胞培养与常用病毒学技术,（1）照胚：在气室中部做记号，在靠近胚胎一侧、气室边缘或偏下处划出接种部位。,避开大血管,细胞培养与常用病毒学技术,（2）消毒接种部位,细胞培养与常用病毒学技术,（3）打孔,细胞培养与常用病毒学技术,（4）接种,稀释病毒液 0.10.2ml/胚,细胞培养与常用病毒学技术,细胞培养与常用病毒学技术,（

27、5）石蜡封口,细胞培养与常用病毒学技术,（6）置37温箱培养 每日照胚、24小时内死胚弃之，根据不同病毒培养至合适时间。,接种后，收获时间视不同病毒而异。 一般收集死亡鸡胚，有些疫苗也收集存活鸡胚。 置冰箱过夜或冰柜0.51 h冷却使血液凝固，避免某些有血凝活性的病毒与红细胞凝集造成病毒滴度下降。 消毒气室处蛋壳，去除蛋壳和壳膜。 收获鸡胚的何种组织，依不同的病毒而定主要考虑组织的含毒量高低。,细胞培养与常用病毒学技术,取出尿囊液、胚胎、尿囊膜，制成匀浆，加适量抗菌素。制备鸭瘟弱毒疫苗时，加入保护剂制成冻干品；匀浆中加甲醛灭活为鸡胚组织灭活苗。,（7）收获全胚或尿囊液,细胞培养与常用病毒学技术

28、,用吸管穿过绒毛尿囊膜插入尿囊腔，吸取尿囊液和羊水，加保护剂冻干即为新城疫弱毒疫苗； 而含新城疫病毒和禽流感病毒的尿囊液用甲醛灭活，加油乳佐剂乳化，即为油苗。,收获尿囊液：,细胞培养与常用病毒学技术,影响病毒增殖的因素： 1）种蛋质量：最终影响到疫苗的质量，应使用SPF鸡胚。 蛋传微生物：白血病病毒、脑脊髓炎、腺病毒、支原体、传染性贫血因子、沙门氏菌等，既污染生物制品，又影响病毒繁殖。 母源抗体：种鸡免疫后、或感染过病原后，种蛋会含有母源抗体，可影响某些病毒在鸡胚中的增殖。,2）孵化技术 温度：鸡胚孵化适宜温度为37.838，病毒繁殖的适宜温度一般为37 。 湿度：鸡胚孵化适宜湿度为53%57

29、%，水禽胚可高5% 10%，过干导致胚胎失去水份，发育不良。 通风：孵化机内设有排风扇，保持箱内空气新鲜。 翻蛋：种蛋大头朝上，定期翻蛋，以改变位置，既可使胚胎受热均匀，利于发育，也可避免胚胎与蛋壳粘连，还可强制胚胎定期活动，促进胚胎发育。,细胞培养与常用病毒学技术,3）接种技术 接种途径：不同病毒有不同的接种途径，需选择合适的接种途径，以获得最高的病毒滴度； 使用不同的接种途径时，需选择合适日龄的鸡胚，保证获得最高量的病毒液； 接种时，不应伤及胚体和血管，以免影响发育，使病毒繁殖速度降低或停止； 操作过程、所用器材，需保持无菌； 需选择合适的收毒时间。,克服上述这些影响因素，旨在获得高滴度的

30、、体积尽可能多的病毒液，即获得足够的抗原量，这是影响病毒性疫苗质量的关键因素。 若抗原量不能满足需要，应对病毒液进行浓缩，虽然成本提高，但能保证效果。病毒抗原的浓缩技术！,细胞培养与常用病毒学技术,（三）用动物培养病毒,动物是繁殖病毒的宿主之一。 1.某些病毒用鸡胚和细胞培养难以繁殖，必需用易感的实验动物或本动物进行繁殖； 2.即使用鸡胚和细胞培养能够繁殖的病毒，在研究和生产中，实验动物或本动物也是必需的，如： （1）强毒株的筛选； （2）制备同源组织脏器苗或高免血清； （3）疫苗各项指标的检测：免疫原性或疫苗效力检验(免疫攻毒保护试验)、疫苗的安全性试验、毒力返强试验、免疫后抗体消长曲线的检

31、测等。,细胞培养与常用病毒学技术,1. 动物的选择标准,2. 接种方法 根据病毒及研究目的的不同，可采用不同途径进行接种：皮下、皮内、肌肉、静脉、腹腔和脑内等接种方式。,（1）对相应病毒易感； （2）大动物，来自非疫区、最好未接种过相应的疫苗、青壮年、健康； （3）家兔、大鼠和小鼠等，应符合实验动物标准； （4）鸡应为SPF鸡或非免疫鸡； （5）犬猫应品种明确，且符合实验动物标准； （6）体重、年龄等要基本一致，个体差异不宜过大。,细胞培养与常用病毒学技术,复习思考题：,1. 简述各类疫苗制造的基本流程。 2. 病毒性疫苗(动物组织苗、鸡胚苗、细胞苗)。,细胞培养与常用病毒学技术,第3节 病毒

32、效价（滴度）测定技术,一、血清学诊断抗原,1.概念：用已知微生物和寄生虫及其组分、代谢产物、感染动物组织制成，用于检测血清中的相应抗体。 2.用途：这类制剂可与血清中的相应抗体发生特异性反应，形成可见的或可以测知的复合物，以确诊动物是否受微生物感染或是否接触过某种抗原。 3.分类：根据检测方法的不同，分为凝集反应抗原、沉淀反应抗原、补体结合反应抗原。,细胞培养与常用病毒学技术,二、凝集反应 颗粒性抗原(如病原微生物或红细胞等)与特异性抗体结合时所出现的凝集现象。根据反应中附加因素的不同，可分为下述几种形式： 直接凝集反应： 红细胞凝集反应：病毒颗粒（如流感病毒）上有血凝素，它与某些脊椎动物（豚

33、鼠、鸡、猴等）的红细胞表面上的受体结合，就会出现非特异性的凝集。 这种病毒血凝现象可被特异性抗体抑制，产生血凝抑制反应。用这种反应鉴定病毒型和株以及测定特异性抗体。,细胞培养与常用病毒学技术,间接凝集反应：将小分子抗原吸附在无关颗粒（如红细胞、乳胶颗粒、活性炭等）上，再与对应抗体作用而出现的凝集反应。反之，若将抗体预先吸附在无关颗粒上，再与对应抗原作用出现凝集，这叫做反相间接凝集反应。例如： 间接血凝反应：将抗原成分吸附或结合在红细胞上，然后加入相应的抗体，由于抗体与抗原的特异结合，而把结合抗原的红细胞间接（被动）凝集起来,这时，红细胞起到载体的作用，能使微量可溶性抗原与抗体结合，成为肉眼可见

34、的血凝现象。间接血凝反应是检测抗体的敏感方法。例如，可用脑膜炎球菌、沙门氏菌的抗原成分、乙型肝炎表面抗原与红细胞结合以检测病人血清中相应的抗体。 若将特异性抗体结合于红细胞上，通过血凝反应检测相应的抗原，则称为反向间接血凝反应。这是检测微量抗原（如毒素、细菌成分）和早期快速诊断传染病的敏感方法，现已用于诊断脑膜炎、布鲁斯氏菌病、出血热、病毒性肝炎等。,细胞培养与常用病毒学技术,三、沉淀反应 在有适量电解质的情况下，可溶性抗原与对应抗体结合，形成沉淀物的反应。广泛被应用于鉴定混合系统的蛋白组分，鉴定菌型，诊断疾病以及在法医学上鉴定血迹。 凝胶扩散：以琼脂凝胶或其他类似物质为介质进行的沉淀试验。把

35、抗原和抗体分别放在介质中，经扩散后，抗原与抗体相遇处就形成沉淀线。凝胶扩散可用于抗原-抗体系统的定性和定量分析。凝胶扩散法分为单向和双向两类。 对流免疫电泳：在电场作用下进行的双向凝胶扩散。其原理是：在通电的琼脂中，抗原和抗体向相反的电极移动,当它们在最适宜的比例处相遇时,可形成白色的沉淀线。实际上，这是一种加速的双向琼脂扩散试验。试验所需时间短、敏感性高，但特异性较差。一般用于各类蛋白的定性和半定量测定。,细胞培养与常用病毒学技术,四、中和试验 将抗体与毒素或病毒结合，使毒素失去毒性或使病毒失去传染力的免疫学试验。可用以辅助诊断疾病，或鉴定病毒、某些未知病原体和毒素等。能在动物、鸡胚或组织培

36、养中进行。 病毒中和试验：用于检查患过某些病毒疾病或免疫机体血清中抗体的增长情况的方法。也可用于鉴定病毒和研究抗原结构。一般用不同稀释度血清与定量病毒等量混合，放置一定时间，然后接种到细胞培养管中，每天观察细胞病变，以能抑制细胞病变的血清最高稀释度作为终点效价。这一试验多采用细胞培养，比动物和鸡胚试验经济而方便。中和抗体特异性高，维持时间较长，是流行病学调查常用的方法。,细胞培养与常用病毒学技术,五、酶联免疫吸附试验 简称酶标法，是20世纪70年代新开展的一项免疫血清学技术。当抗原或抗体结合到固相载体表面时，仍能保持自己的免疫活性。把抗原或抗体与酶的结合物再与相应的抗体或抗原结合，即可根据加入

37、酶底物的颜色来判定有无相应的免疫反应。颜色的深浅与标本中相应抗体或抗原的量成正比。酶标法和放射免疫技术同是既特异又敏感的方法。 酶标法中最常用的是间接法和双抗体夹心法。间接法用于测定抗体。双抗体夹心法用于测定抗原。 酶标法具有特异、敏感、快速、简便和经济等特点，原则上可用于检测一切抗原、半抗原和抗体。目前已用酶标法测定血清蛋白质、肿瘤抗原、激素、药物、各种微生物和寄生虫的抗原，以及上述各种抗原所产生的相应抗体。在临床诊断、疾病普查、法医鉴定、兽医检查、植物病害检验等方面应用广泛。,细胞培养与常用病毒学技术,六、TCID50、LD50、EID50,将病毒细胞培养物在灭菌离心管中作连续10倍稀释，即取10