USP 微生物试验

1、,新USP/EP/JP 藥典微生物檢驗方法,USP Microbial Limits,Microbial Limit Tests” into two chapters: Microbial Enumeration Tests: Total aerobic microbial count (TAMC)-嗜氧性總生菌數 Total combined yeasts and molds count (TYMC)- 總黴菌及總酵母菌數 Tests for specified microorganisms New Harmonised Media: Changes Absence of Specified

2、 Microorganisms Salmonella-沙門氏桿菌 Pseudomonas aeruginosa -綠膿桿菌 Staphylococcus aureus-金黃色葡萄球菌 Escherichia coli -大腸桿菌 Clostridium spp. -梭狀產芽孢菌 (formerly Cl. perfringens) Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria-膽鹽忍受性革蘭氏陰性菌 (formerly Enterobacteriaceae) Candida albicans-白色念珠菌(NEW),藥品的微生物檢驗主要包括無菌性試驗，總生菌數測定，黴

3、菌及酵母菌數測定，以及病原菌的檢驗等。不同製劑的微生物檢驗要求不完全相同 微生物限量檢驗法之目的，在於提供測定各種藥品自原料至最終成品中，嗜氧性總生菌數及特定生菌種類之檢驗方法 在試驗之準備及操作中，對於檢品之處理需嚴格注意無菌操作技術勿受細菌污染,Method of the examination,Membrane filtration Plate-count method - pour-plate method - surface-spread method Most-probable-number method,Membrane filtration,0.45m 濾膜，每 1 個稀釋倍數

4、至少進行二重覆 TAMC : TSA 3035培養 35天 TYMC : SDA 2025培養 57天,結 果 判 讀,由兩個培養皿中菌落數之平均值乘以其最終稀釋倍數，即為每 g 或 mL檢體之微生物總數 若於10 倍稀釋檢液之培養皿中無菌落產生，表至此檢體每 g或每 mL之微生物總數為1 個以下。以1 CFU/g（mL）表示,Plate-count method Pour plate,每 1 個稀釋倍數至少進行二重覆 TAMC : TSA 3035培養 35天 TYMC : SDA 2025培養 57天,Plate-count method - Surface spread,取不少於0.1

5、mL進行塗抹 每 1 個稀釋倍數至少進行二重覆 TAMC : TSA 3035培養 35天 TYMC : SDA 2025培養 57天,結 果 判 讀,並選取250 CFU (總生菌數) 、50 CFU (黴菌及酵母菌數)的菌落之兩個培養皿來計算菌落的數量 由兩個培養皿中菌落數之平均值乘以其最終稀釋倍數，即為每 g或 mL檢體之微生物總數 若於10倍稀釋檢液之培養皿中無菌落產生，表至此檢體每 g或每 mL之微生物總數為10 個以下。以10 CFU/g（mL）表示,Most-probable-number method,結 果 判 讀,對照組：應保持澄清（即應無菌生長），否則試驗無效 試驗組：可

6、由下表查出檢體每g或每mL最可能含有好氧性微生物之總數 若在判讀上出現困難，則重新活化在相同的broth 或 TSA上，以30 35培養 1 2天,嗜氧總生菌數,黴菌及酵母菌數,Test for specified microorganisms 1. 大腸桿菌 (Escherichia coli ) 2. 沙門氏菌 (Salmonella typhimurium ) 3. 金黃色葡萄球菌 (Staphy. aureus ) 4. 綠膿桿菌 (Pseudo. aeruginosa ) 5. 膽鹽忍受性革蘭氏陰性菌 (Enterobacteriaceae) 6. 梭狀產芽孢菌 (Clostridi

7、um spp.) 7. 白色念珠菌 (Candida albicans),Growth promotion and Inhibitory properties of the media,大腸桿菌 （Escherichia coli）之檢驗,大腸桿菌 革蘭氏陰性桿菌，腸桿菌科埃希氏菌屬 (Escherichia) 部分血清型的大腸桿菌可引起腸道感染，稱為致 瀉性大腸桿菌根據其致病特點分為五種： 腸病原性大腸桿菌(EPEC) 腸侵襲性大腸桿菌(EIEC) 腸產毒性大腸桿菌(ETEC) 腸出血性大腸桿菌(EHEC) 腸黏附性大腸桿菌(EAEC),EMB agar,Escherichia coli,M

8、acConkey agar,陰性桿菌,TSIA CIT URE SIM VP ORN ARG LYS,OXI 無色,GNB-14,沙門氏菌 (Salmonella spp. ) 之檢驗,沙門氏菌 革蘭氏陰性桿菌，沙門氏菌對外界抵抗力較強，但對熱耐受力差；對人類可引起傷寒和副傷寒腸炎、腹瀉（食物中毒）及敗血症等 沙門氏菌引起的疾病稱為沙門氏 (salmonellosis)。引起沙門氏菌性腹瀉最常見者有鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)及腸炎沙門氏菌 (S. enteritidis)，而引起敗血症常見者如和霍亂沙門氏菌 (S. choleraesuis) 引起沙門氏菌性腹瀉的藥品，常由

9、動物性原料所製成，引起腹瀉菌量約為105 cfu/g 以上,BG agar,BS Agar,XLD agar,Salmonella spp.,TSIA (Triple Sugar-Iron-Agar) Medium,Salmonella spp.,Salmonella spp.-多價自體（O）抗血清試驗 （Polyvalent Somatic（O） Test）,將載玻片分為兩區，於其中1 區滴 1 滴抗血清溶液，另 1 區則滴 1 滴無菌生理食鹽水 取1 loop TSI斜面上培養24 48小時之菌落，分別均勻懸浮於玻片上血清及生理食鹽水中 前後搖動玻片1分鐘（不可使兩區之菌液互混），於光源下

10、觀察結果,金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 之檢驗,金黃色葡萄球菌 革蘭氏陽性球菌，於人體皮膚、毛髮及鼻腔、咽喉等黏膜，尤其是化膿的傷口；有些菌株污染食品後會產生腸毒素，達到一定劑量可引起腹瀉 腸毒素之產生與食品的性質和組成分有關，一般說來pH 為6.08.0，水分、蛋白質或澱粉含量比較豐富的食品中，該菌最易繁殖並產生毒素 金黃色葡萄球菌對外界環境 的抵抗力強於其他無芽孢菌，對 乾燥有一定的耐受性,Mannitol Salt agar,Baird-Parker agar,Staphylococcus aureus,Catalase test(觸酶試驗) 陽性/產生

11、氣泡,Coagulase test(凝固酶試驗) 陽性/出現凝集現象,Staphylococcus aureus,Staphylococcus aureus (gram-positive cocci),綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa)之檢驗,綠膿桿菌菌 Pseudomonas aeruginosa在分類上屬於假單胞菌屬(Pseudomonas)，是一種伺機性致病菌 P. aeruginosa為銅綠色的意思，因為大多數的綠膿桿菌會分泌兩種水溶性色素，一種為非螢光性、淡藍色的綠膿青素(pyocyanin)另一種則為淡綠色的螢光素(Pyoverdin，又稱為fluoresc

12、ein)。生長在培養基上有香味,Pseudomonas aeruginosa,Cetrimide Agar,Pseudomonas agar F,Pseudomonas agar P,氧化酶試驗,陽性 陰性,腸桿菌科（Enterobacteriaceae） G()菌中數目最多種類最複雜，32屬，140多種。環境中無所不在，亦屬正常的腸道菌叢 敗血症(30-35%)、尿道感染(70%)、腸道感染 腸內細菌科細菌的主要特性 0.3 1.0 1.0 6.0 m，革蘭氏陰性桿菌 有些具運動性，有些則無；不形成孢子 營養需求簡單，在有氧或無氧的一般培養基 (blood agar)生長迅速，能發酵葡萄糖；

13、缺乏氧 化酶（oxidase），是與其他G()桿菌分別的 主要依據,1. 若細菌的生長良好而呈現紅色或是帶紅色菌落的革蘭氏陰 性桿菌，將為腸內菌。 2. 參考計算每g(mL)之最大可能菌落數。 範例：若結果0.1 g，0.01 g，0.001 g三種稀釋濃度均為， 則每 g (mL)含有腸內菌的最大可能菌落數超過103。,Violet-Red Bile Glucose Agar,腸內菌的最大可能菌落數（MPN）,Growth promotion of the media,梭狀產芽孢桿菌 (Clostridium species ) 之檢驗,梭狀產芽孢桿菌 革蘭氏陽性的厭氧桿菌，C. sporo

14、genes分布廣，主要是生活在無氧的環境內。在芽孢的生成後往往對環境有較高的耐受能力。 Blood Agar plant 上的C. sporogenes 長成一個直徑大約2-3 mm的不規則環狀菌落 引起食物腐敗 : C. sporogenes 與C. botulinum 人體致病性 : C. sporogenes對人類沒有致病性,100 mL,培養 3035，48 2 小時,Columbia agar,Columbia agar,Columbia agar,Columbia agar,厭氧 嗜氧,厭氧 嗜氧,若厭氧生長，嗜氧不生長，則可能為Clostridium 若厭氧生長，嗜氧生長，則非為

15、Clostridium 若厭氧不生長，嗜氧不生長，則非為Clostridium,100 mL,註：Catalase使用 15 H2O2（過氧化氫）操作， 若產生氣泡即為陽性反應，無氣泡則為陰性反應。,Reinforced Clostridial Medium 混濁 Columbia agar 嗜氧不生長，厭氧生長 Gram Stain 陽性桿菌 Catalase test 陰性,Clostridium Species,Growth promotion of the media,白色念珠菌 (Candida albicans ) 之檢驗,1. 將不少於1 g 之檢體以Sabouraud Dext

16、rose Broth (SDB)配製10倍稀釋檢液，於 2025培養57天 2. 取 1 loop之10倍稀釋檢液接種在SDA，在2025培養2天 3. 若生長的菌落呈現乳白色，則疑似為Candida albicans ，進行鑑定試驗 4. 鑑定試驗: 4.1 發芽管試驗 4.2 Chromogenic agar,Growth promotion of the media,發芽管試驗 (Germ tube serum),Candida albicans Positive Germ Tube Test,1. 取 1 loop量的酵母菌，加入0.5 mL的動物血清。 2. 於35培養23 小時。 3. 取 1 滴下層沈澱物置於載玻片上。 4. 蓋上