原生质体融合技术简介PPT课件

1、。1、原生质体融合，一个原生质体融合和两个原生质体融合的特点，原生质体融合的三个过程，原生质体融合的四个应用。2，一原生质体融合，定义：原生质体融合是通过酶解剥离双亲的细胞壁，使其在高渗环境下释放出仅被原生质膜覆盖的球形原生质体。然后，将双亲的原生质体在高渗条件下混合，用聚乙二醇融化使它们互相凝集，然后通过细胞质融合进行两次基因组接触、交换和基因重组，在再生细胞中获得重组体。1.原生质体融合，原理：将两种不同基因型的细胞用合适的水解酶剥离细胞壁后，在融合剂的作用下，两种原生质体接触融合成异核体，再通过繁殖和复制进一步融合形成杂种二倍体，然后通过染色体交换产生重组体，达到基因重组的目的。最后，对

2、重组体的生产性能、生理生化特性和遗传特性进行了分析。4，原生质体融合的特点，1杂交频率较高。由于原生质体没有细胞壁的屏障，在原生质体融合中加入聚乙二醇，微生物原生质体间的杂交频率明显高于常规杂交方法。2.受接合或生育力的限制，因为亲本菌株可以作为受体或供体，它有利于不同物种和属之间的微生物杂交。此外，由于原生质体融合是一种与生育力无关的细胞杂交，它较少受到接合或生育力的限制。重组体的种类很多，因为原生质体融合后，两个亲本植物的整个基因组相互接触，并有机会进行多次交换，从而产生各种基因组合，获得各种类型的重组体。遗传物质的传递更加完整。原生质体融合是两个亲本植物细胞质和细胞核结合的类似过程，因此

3、遗传物质的交换更加完整。原核微生物可以用来携带两个或多个完整的基因组。5具有优良性状的重组体可以与其他育种方法结合，从其他方法获得的优良性状可以通过原生质体融合结合成单一菌株。6能提高育种(筛选)效率。一个亲本的原生质体通过温度、药物或紫外线照射钝化，然后与另一个亲本的原生质体融合，因此在筛选过程中可以除去一个亲本，从而提高筛选效率。使用具有较高产量性状的菌株作为融合亲本是可能的，因为遗传标记，如营养缺陷型，经常影响工业微生物的某些生物合成能力，并且在一般的基因重组中必须使用更多的遗传标记，这将不可避免地降低原始菌株的生产性能并影响杂交后代的生产水平。然而，由于原生质体融合的频率很高，通过使用

4、很少标记或没有标记用于融合的菌株来提高生产菌株的性能是非常有效的。8有助于建立工业微生物的转化体系，原生质体融合的过程，亲本植物，A，B，原生质体，融合，酶解，融合，再生，再生用遗传标记筛选亲本进行原生质体制备，原生质体再生和再生频率计算原生质体融合，形态学，生理学，生物化学和遗传分析对重组体进行检查和鉴定，并筛选标记菌株，用于原生质体融合的亲本需要携带遗传标记以方便重组体的检测。营养缺陷型和抗性是常用的标记，但也可以用热死、孢子颜色和菌落形态作为标记。在实践中应该使用什么样的遗传标记应该根据实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是进行遗传分析，则应使用具有隐性基因的营养缺陷型或抗性菌株；如果

5、从育种的角度进行原生质体融合，因为大多数营养缺陷型菌株会影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷型标记时，必须避免使用影响正常代谢的营养缺陷型菌株。原生质体的制备、原生质体的制备和获得完全去壁的活原生质体是原生质体融合育种技术的前提。在细菌和放线菌中，溶菌酶主要用于制备原生质体；为了制备葡萄球菌原生质体，有必要用溶葡萄球菌酶处理它们。蜗牛酶通常用于制备酵母原生质体。蜗牛酶可以用于制备丝状真菌的原生质体，但是在制备丝状真菌的原生质体时，两种或三种酶是混合的。此外，影响原生质体制备的因素很多，主要是细菌的性质、酶和反应环境。10，(1)细菌的预处理为了使酶的效果更好，可以对细菌进行一些预处理，主要是

6、向培养基中加入一些物质，加入这些物质的目的是增加细菌细胞壁对酶的敏感性。例如，青霉素会干扰甘氨酸交联桥与四肽侧链上的D-丙氨酸之间的连接，使细菌无法合成具有空间网络结构的完整薄壁，导致细胞壁结构松散，便于溶菌酶处理。(2)细菌的培养时间与微生物的生理状态有关。为了使细菌细胞的原生质体比率容易，通常选择对数生长期的细菌。此时，细胞生长和代谢旺盛，细胞壁对酶水解最敏感。由此获得的原生质体具有高的形成率和高的再生率。酶浓度对于不同种类的微生物，不仅对酶的种类要求不同，而且酶的浓度也不同。一般来说，随着酶浓度的增加，原生质体形成率也增加，超过一定范围，但原生质体形成率的提高不明显。酶浓度过低，不利于原

7、生质体的形成；如果酶浓度过高，原生质体的再生率将会降低。因此，建议原生质体形成率和再生率乘积达到最大的酶浓度为最佳酶浓度。(2)酶解温度据报道，酶解温度对原生质体再生有很大影响。因此，在选择最佳酶解温度时，除了酶的最佳温度外，还应该用原生质体再生率来校正。(3)酶解时间太短，原生质体形成不完全，影响原生质体融合；如果酶解时间过长，原生质体会完全分离，原生质体的质膜容易被破坏，影响原生质体的再生，最终不利于原生质体融合。因此，为了使融合实验成功，有必要选择合适的酶解时间。渗透压，如渗透压稳定剂，不仅可以防止原生质体膨胀，而且有助于酶和底物的结合。渗透稳定剂主要是无机物，如Kcl和氯化钠，以及有机

8、物，如甘露醇、山梨醇、蔗糖和琥珀酸钠。不同的菌株有不同的最佳稳定剂。蔗糖、琥珀酸钠、氯化钠等在细菌中被广泛使用。山梨、甘露醇等。广泛用于酵母中；氯化钾和氯化钠在模具中被广泛使用。稳定剂的使用浓度通常在0.3至0.8摩尔/升之间.此外，pH值、培养基组成、培养方式、离子强度和种类对原生质体的形成也有一定的影响。在原生质体再生中，通过酶解和去壁获得的原生质体应该具有再生能力，即能够重建细胞壁，恢复细胞完整性，生长和分裂，这是原生质体融合育种的必要条件。只有细胞质膜的原生质体对渗透压敏感，容易破裂，导致原生质外流和细胞死亡。因此，再生介质必须有必要在再生培养基中加入一定渗透压的培养基，也就是说，用渗

9、透压稳定剂再生原生质体是一个非常复杂的过程。一些学者认为，如果原生质体的细胞壁没有被完全剥离，将有助于细胞壁的再生，残留的细胞壁就像结晶过程中的“籽晶”。大量的实验也证明，太彻底的破壁经常会导致原牛质体的再生率大大降低。14，在融合实验之前，通常有必要测量原生质体的再生率，否则很难确定不能融合或融合频率低是由于亲本原生质体的失活或再生率低，还是由于不合适的融合条件。因此，原生质体形成率和再生率的测定不仅可以作为检验和改善原生质体形成和再生条件的指标，也可以作为分析融合实验结果和改善融合条件的重要指标。计算原生质体再生率的公式为：原生质体再生率=(再生平板细菌数-低渗透剩余细菌数)/(破壁前细菌

10、数-低渗透剩余细菌数)。一般来说，原生质体再生率往往只有百分之几到百分之几十，甚至每一个都可以达到100%。如果原生质体不能恢复到原始细菌的正常状态，就不可能将微生物的原生质体用于遗传操作。原生质体的融合频率仍然很低，但只能通过添加表面活性剂聚乙二醇(PEG)来实现，它有4000和6000两种分子量。原生质体融合过程中，除聚乙二醇外，还应加入钙、镁等阳离子，这也能促进融合。当在钙离子存在下融合时，酸碱度是碱性的，这可以刺激最大融合频率，因为酸碱度可以改变系统的电状态，从而影响原生质体融合。由于聚乙二醇既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于20%将导致原生质体破裂并失去稳定性，浓度过高将导致原生质

11、体收缩并降低融合频率。因此，聚乙二醇的最终浓度通常为30%-40%。一旦加入干聚乙二醇，原生质体之间的粘附力是多少？如果发生强烈的融合，可以长时间有效地进行融合，因此聚乙二醇的加工时间不应太长。此外，聚乙二醇在高浓度下是有毒的，因此融合时间不应太长。有人指出，融合前用紫外线照射原生质体可以大大增加融合的频率。16、此外，物理因素也能促进细胞融合，主要是电融合技术。电融合是以空间定向和时间同步的可控方式实现原生质体融合，从而改变化学融合(聚乙二醇融合)的随机过程。同时，融合频率高，操作简单快速，对细胞损伤小，可以在显微镜下进行。融合子的选择。原生质体融合后，重组融合子的选择方法是原生质体融合技术

12、应用的关键。根据schaeffer，两个遗传标记是互补的，可以被鉴定为融合子。因此，利用这些选择性遗传标记可以在选择性培养基上筛选出融合子。然而，原生质体融合后有两种情况，一种是真正的融合，即产生杂种二倍体或单倍体重组体；另一种是暂时融合形成异核体。它们都可以在选择性培养基上生长。一般来说，前者是稳定的，而后者是不稳定的，可以分为亲本类型，有些甚至可以在异核状态下转移到几代。因此，为了获得真正的融合子，有必要在融合原生质体再生后进行几代自然分离和选择，然后才能确定。常用的融合子筛选方法有两种：直接法、间接法和被动选择法。18、(1)直接法，原生质体融合后，可直接分离成MM或SM，并可直接检测融

13、合细胞。它的优点是只需要一个步骤就可以获得重组体，而大多数重组体是稳定的，但是它的缺点是很难检测那些其表型被延迟并且其基因已经被重组的融合体。(2)用间接法在培养基上分离融合产物，使原生质体再生，融合和未融合的原生质体都能生长，然后在培养基上分离。其优点是能更好地促进细胞再生，表型延迟重组易于检测。缺点是需要两个步骤来检测重组体，这需要大量的人力和物力，并且获得的重组体不稳定。直接法和间接法都应该标记营养缺陷型，并且获得的重组体可能不会增加目标产物的产量。(3)钝化选择方法钝化选择方法是指灭活原生质体和活性原生质体的融合。亲本植物中的一种(野生型)原生质体在50C热处理2-3小时，使得融合前原

14、生质体代谢途径中的一些酶失活且不能再生，然后与另一种(双缺陷型)原生质体融合并分离成MM。除了加热，失活也可以用紫外线或药物处理。筛选实用菌株，微生物原生质体融合是一种新的基因重组技术，具有定向育种的意义。然而，融合后产生的融合子的类型仍然各不相同。不同的性能和不同的产量仍然存在，所以必要的人工筛选仍然是非常重要的，主要是关于遗传稳定性的实验。原生质体融合育种的应用，陈宁等人以球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌H4为亲本(前者对淡色库蚊毒性大，后者对粘虫和玉米螟毒性大)，以2-3 mg/ml溶菌酶浓度酶解45分钟获得原生质体。原生质体形成率和再生率分别为91.2%和91.2%，然后将原生质体按比例混合，加入40%的聚乙二醇，在42孵育5m