02 实验二 产中性蛋白酶芽孢杆菌的诱变育种

1、微生物学实验技术,一株产中性蛋白酶芽孢细菌的选育,山东农业大学生命科学学院 微生物学系 2013.09,实验内容,一、产中性蛋白酶芽孢细菌的初步筛选 二、产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种 三、产中性蛋白酶芽孢细菌的发酵复筛 四、产中性蛋白酶芽孢细菌的分类鉴定 五、产酶菌株生长曲线的测定 六、产酶菌株的菌种保藏,实验二 产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种,一、目的意义 二、材料方法 三、数据结果 四、讨论分析 五、参考文献,一、目的意义,1、通过菌种选育，筛选获得一株高产中性蛋白酶的突变菌株。,关键技术:,实验原理：紫外线诱变 技术路线：,二、材料方法,紫外线的波长在200380 nm 之间，但对诱变

2、最有效的波长仅仅是在253265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。,紫外线诱变育种的原理,紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。,经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要

3、贮放太久，以免突变在黑暗中修复。,诱变育种中的几个原则,指利用物理或化学诱变剂处理微生物群体细胞，促进其突变率显著提高，然后设法从中选取少数符合育种目的的突变株。,2个主要环节：,诱变（随机）,选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。,筛选（定向）,设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。,（一） 出发菌株（original strain）,出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。,具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、 标记明显等）； 对诱变剂敏感,野生型菌株； 从生产中选育的自发突变菌株； 诱

4、变获得的高产菌株,出发菌株的选择标准：,出发菌株的来源：,（二） 菌悬液的制备,1. 选用单细胞或单孢子悬液（均匀、分散）,目的：使每个细胞能均匀接触诱变剂； 减少表型延迟现象（诱变后性状的分离及退化现象）,2. 同步培养（生理状态一致）,3. 菌龄：对诱变剂最敏感时期 营养细胞：对数期 孢子或芽孢：萌发前期,4.菌悬液的制备方法 物理诱变：生理盐水配制 化学诱变：缓冲液配制,5. 菌悬液的浓度 酵母菌，霉菌的孢子：106个/mL 细菌，放线菌孢子：108个/mL,（三）诱变剂的选择及处理方法,1. 诱变剂的选择（高效，简便）,物理诱变剂：频度低、大损伤，难修复，且操作简便； 化学诱变剂：频度

5、高，点突变，易回复突变，操作麻烦。 ( NTG超诱变剂）,UV是最常用的一种诱变剂,2. 剂量的选择,突变率随剂量的增加而提高，但到达一定程度后，再提高剂量, 反而会使突变率下降。 正变较多出现在偏低剂量中，而负变较多出现在偏高剂量中。,在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为7075%, 甚至3070%的剂量。,UV的剂量: 固定UV功率和照射距离,以照射时间长短来确定剂量多少。,最适剂量：在提高突变率的基础上，既能扩大变异幅度， 又能使变异向正突变范围移动的剂量。,常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线）,3. 诱变处理方法,单因素处理或多因素的复合处理： 同一诱变剂的重复使用； 两种或多

6、种诱变剂的先后使用； 两种或多种诱变剂的同时使用.,（四） 中间培养（CM，培养过夜）,目的：克服表型延迟,表型延迟（phenotypic lag）：表型的改变落后于基因型改变的 现象. 分离性延迟： 突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯 合状态，表型才能表现出来。 生理性延迟： 由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能 表现出来。,生理性延迟:,分离性延迟的原因: 对数生长期中，单核细胞常出现双核现象，多核细胞的核也成倍增加，诱变对数期的细胞时，突变通常发生在一个核上，故其变异或非变异的细胞必须经过一代或几代繁殖才能分离，这种纯种变异细胞出现的推迟现象称为分离延迟现象。,生理性延迟的原因:

7、 当变异细胞由杂合状态变为纯合状态时,由于杂合期所合成的非变异的蛋白或酶仍然发挥作用,必须经过细胞多代分离后,才能将这些非变异的酶稀释掉,最终达到变异后应该表现的形态,如营养缺陷型突变株的筛选过程。,（五）突变株的筛选,初筛 复筛,1. 初筛（以量为主）,（1）利用形态变异：需预先测定形态与产量的相关性,（2）根据平板颜色反应直接挑选 透明圈法（蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶）； 抑菌圈法（抗生素）； 变色圈法（柠檬酸）、显色圈（氨基酸）； 沉淀圈法（外毒素） 透明圈直径（H）/菌落直径（C）：产量高低（初筛指标）,2. 复筛（以质为主，定量测定）,摇瓶培养，直接检测所需产物,方法需简便、快速,2步

8、,诱变育种的基本原则：,选择简便有效的诱变剂； 挑选优良的出发菌株； 处理单细胞或单孢子悬液； 选用最适的诱变剂量； 充分利用复合处理的协同效应； 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标； 设计高效筛选方案； 创造新型筛选方法。,出发菌株（纯化） 前培养（ 培养至对数期） 菌悬液制备 活菌计数 诱变预备实验（剂量存活率曲线） 诱变处理（相对杀菌率为70-75%，30-70%） 活菌计数 中间培养（培养过夜，克服表型延迟） 突变株分离 初筛 复筛 生产性能试验 菌种（鉴定与）保藏,技术路线：,第一次实验：,讨论并设计实验方案； 实验材料准备：培养基、无菌水、离心管等； 活化：LB培养基，37摇床

9、振荡16-20h,LB发酵液体培养基 蛋白胨：10.0g； 酵母膏： 5.0 g； 氯化钠：10.0g； 蒸馏水：1000ml pH到 7.0。,第二次实验：,（一）菌剂准备： 离心收集（8000rpm，5min）活化好的菌种； 倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 用无菌生理盐水悬浮菌液，配制成约1.0 108/ml,第二次实验：,（二）诱变处理： 预热：在正式照射前，应先开紫外线30min，让紫外灯预热。 搅拌：取5ml制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。 照射：打开皿盖边搅拌边照射，所有操作必须在黑暗或红灯下

10、进行。,第二次实验：,（三）培养： 稀释：在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各1 ml进行适当稀释分离。 涂布：取适宜稀释度的稀释液0.1ml涂于酪蛋白平板上。 培养： 37培养48h， (用黑布包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别等。,第三次实验：,统计：菌落计数并测量透明圈大小，从中挑选出目标菌株。 转接：挑取生长饱满的单菌落转接入LB试管斜面，每个分离物转接5支试管。 保藏：37培养24h，保藏备用； 讨论下一步实验方案（发酵法复筛）并准备实验材料；,三、数据结果,四、讨论分析,致死率 诱变率 评价体系 ,五、参考文献（举例）,1 李红亚等，芽孢